Диета для профилактики демиелинизации. Маркеры нарушений нервной системы Рекомендованный список диссертаций
Основной белок миелина (ОБМ) - один из главных белковых компонентов миелина центральной нервной системы , составляющий около 30% общего содержания протеинов в миелине . ОБМ не является интегральным мембранным белком. Различают его растворимую фракцию, присутствующую в цитоплазме олигодендроцитов перед включением в мембраны миелина, и нерастворимую, входящую в состав миелина. В миелине ОБМ локализован с цитоплазматической стороны элементарной мембраны [ Davies L., Sonston G. 1974 ].
ОБМ играет важную роль в организации, сборке и поддержании структурной целостности миелина. Выделены участки белка, стимулирующие рост астроглии (полипептидная цепочка 44-59), усиливающие синтез элементов соединительной ткани (полипептидная цепочка 44-166) [ Shefflld W., Kim S. 1977 ]. Установлено, что ОБМ инактивирует ряд ингибиторов сериновых протеиназ - антитрипсина и микроглобулина , обладает лектиноподобной активностью, специфической к галактозным и галактозаминовым остаткам [ Lisak R.P., Zweiman D. 1977 ].
Парентеральное введение ОБМ вызывает развитие аллергического лейкоэнцефалита , сопровождающегося диффузной демиелинизацией [ Жаботинский Ю.М. 1975 ]. Было установлено, что разные пептидные фрагменты молекулы ОБМ могут проявлять энцефалитогенные свойства. Наиболее вероятным носителем энцефалитогенной детерминанты всего белка является нонапептид с последовательностью аминокислот 114-122 (-Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg-) [ Хохлов А.П., Баскаева Т.С. 1986 ].
Генная мутация, ведущая к недостаточному синтезу ОБМ у экспериментальных животных, приводит к развитию демиелинизирующего процесса в мозге и появлению гиперкинезов (модель "трясущихся" мышей) [ Ulrich J. 1993 ]. Введение белка на ранних стадиях эмбриогенеза в зародыш трансгенных животных предотвращает развитие характерной неврологической симптоматики и раннюю смертность [ Ulrich J. 1993 ].
Все открытые свойства ОБМ позволяют связать нарушения его метаболизма с развитием демиелинизирующего процесса. В связи с этим определение ОБМ и антител к нему проводили в основном у больных с рассеянным склерозом и другими демиелинизирующими заболеваниями . Деструкция белого вещества мозга сопровождается выходом ОБМ из пораженной ткани и накоплением его в цереброспинальной жидкости, в связи с чем уровень белка может являться чувствительным индикатором выраженности патологического процесса. Проникая через гематоэнцефалический барьер, ОБМ и его фрагменты стимулируют синтез антител к компонентам миелина, что поддерживает течение заболевания.
Исследования ОБМ при сосудистой патологии головного мозга фрагментарны. Экспериментально показано, что априорная сенсибилизация к ОБМ значительно ухудшает прогноз инсульта и увеличивает размеры инфаркта мозга . В клиническом исследовании J. Palfreyman с соавт. [ Palfreyman J. 1979 ] выявлено увеличение концентрации ОБМ в сыворотке крови больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения, сохранявшееся на протяжении первых 7 дней заболевания. Отмечена корреляция между уровнем ОБМ в сыворотке крови и прогнозом инсульта.
Определение концентрации основного белка миелина в ликворе, используемое для диагностики, оценки прогноза и контроля лечения рассеянного склероза.
Синонимы русские
ОБМ в спинномозговой жидкости, в СМЖ.
Синонимы английские
Myelin basic protein (MBP), CSF.
Метод исследования
Иммуноферментный анализ (ИФА).
Единицы измерения
Нг/мл (нанограмм на миллилитр).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Подготовки не требуется.
Общая информация об исследовании
Основной белок миелина, ОБМ – это один из главных компонентов внутреннего слоя оболочки миелина. При демиелинизации ОБМ и/или его фрагменты поступают в спинномозговую жидкость и поэтому могут быть использованы в качестве клинико-лабораторного маркера разрушения миелина для диагностики, оценки прогноза и контроля лечения рассеянного склероза.
Показано, что повышение уровня ОБМ в ликворе наблюдается примерно в 80 % случаев обострения рассеянного склероза и лишь у немногих пациентов в ремиссии заболевания. Нарастание уровня ОБМ соотносится с прогрессированием изменений по данным МРТ и сохраняется в течение 5-6 недель после начала обострения. На фоне терапии глюкокортикостероидами концентрация ОБМ снижается.
Если рассеянный склероз проявляется только в виде ретробульбарного неврита, повышения ОБМ в ликворе, как правило, не наблюдается. Это, вероятно, обусловлено тем, что очаг демиелинизации в этом случае расположен на относительно большом расстоянии от четвертого желудочка головного мозга. Другой особенностью ОБМ является то, что при высвобождении из миелина ОБМ может подвергаться фрагментации с образованием множества разных по структуре компонентов, не все из которых могут быть идентифицированы с помощью стандартных тест-систем. Результат исследования в таком случае не всегда соответствует реальной концентрации ОБМ в ликворе.
Повышение ОБМ наблюдается не только при рассеянном склерозе, но и при других заболеваниях ЦНС, например при инсульте , некоторых энцефалопатиях и энцефалитах. Более того, так как ОБМ также обнаруживается в периферических нервах, его концентрация в ликворе может изменяться при наличии демиелинизации нервных волокон за пределами ЦНС. Таким образом, ОБМ – это неспецифический маркер рассеянного склероза.
Следует отметить, что на сегодняшний день ОБМ – это дополнительный маркер рассеянного склероза . Как и другие маркеры ликвора (олигоклональные иммуноглобулины G, IgG-индекс), он не входит в основной алгоритм диагностики рассеянного склероза.
Для чего используется исследование?
- Для диагностики, оценки прогноза и контроля лечения рассеянного склероза.
Когда назначается исследование?
- При наличии симптомов рассеянного склероза: нарушение зрения (помутнение, двоение в глазах), слабость, онемение, покалывание в руках и ногах, нарушение равновесия, учащение мочеиспускания, особенно если симптомы носят перемежающийся характер и наблюдаются у молодой женщины;
- при получении неоднозначных результатов магнитно-резонансного исследования головного мозга (МРТ).
Что означают результаты?
Референсные значения: менее 1 нг/мл.
Положительный результат:
- рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания ЦНС;
- инсульт;
- энцефалопатии;
- энцефалиты.
Отрицательный результат:
- норма;
- эффективное лечение заболевания.
Что может влиять на результат?
- Фрагментация основного белка миелина при его высвобождении из миелина;
- наличие сопутствующих заболеваний.
Важные замечания
- Основной белок миелина является неспецифичным маркером рассеянного склероза и других демиелинизирующих заболеваний;
- результаты анализы следует интерпретировать с учетом дополнительных клинических, лабораторных и инструментальных данных.
- Диагностика рассеянного склероза (изоэлектрофокусирование олигоклонального IgG в ликворе и сыворотке)
Кто назначает исследование?
Невролог, врач общей практики.
Литература
- Giovannoni G. Multiple sclerosis cerebrospinal fluid biomarkers. Dis Markers. 2006;22(4):187-96. Review.
- Greene DN, Schmidt RL, Wilson AR, Freedman MS, Grenache DG.Cerebrospinal fluid myelin basic protein is frequently ordered but has little value: a test utilization study. Am J Clin Pathol. 2012 Aug;138(2):262-72.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Анализ фрагментации основного белка миелина под действием протеасомы
А. В. Бачева1#, А. А. Белогуров2, Н. А. Пономаренко2, В. Д. Кнорре2, В. М. Говорун2,
М. В. Серебрякова3, А. Г. Габибов1,2
1 Химический факультет Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова, Москва
2 Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва
3 Протеомный центр РАМН, НИИ Физико-химической медицины Росздрава РФ # e-mail: [email protected]
РЕФЕРАТ Протеасома - это высокомолекулярный белковый комплекс, служащий для направленной деградации белков в эукариотических клетках. Одной из функций протеасом является генерация пептидов, которые затем экспонируются на клеточной мембране с помощью молекул комплексов гистосовместимости как первого, так и второго класса. Есть все основания полагать, что протеасома принимает непосредственное участие в процессе специфической деградации основного белка миелина (ОБМ), составляющего около 30 % всех белков миелиновой оболочки аксонов нейронов. Детали этого механизма остаются невыясненными. В представленной работе изучены особенности специфической деградации ОБМ протеасомой.
Нами было продемонстрировано, что основной белок миелина (не подвергавшийся убиквитинилированию) является хорошим субстратом как для 20S, так и для 26S протеасомы. Впервые были определены сайты протеолиза ОБМ протеасомой из мозга мышей линий Ва1Ь/С и SJL и показаны значительные различия в паттерне деградации данного нейроантигена, что может свидетельствовать о лучшей презентации фрагментов основного белка миелина на комплексах гистосовместимости в случае мышей, предрасположенных к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.
ВВЕДЕНИЕ
Рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенера-тивное заболевание аутоиммунной природы - представляет собой острую медико-социальную проблему, поскольку, как правило, поражает лиц молодого и среднего возраста. Проблема лечения РС остается далекой от разрешения, на сегодняшний день существуют лекарственные препараты, способные в некоторой степени замедлить течение РС, но не излечивать от этой патологии. Деградация нервных волокон, происходящая при рассеянном склерозе, протекает вследствие разрушения миелиновой оболочки нейронов. Одной из биохимических характеристик, которая отличает миелин от других биологических мембран, является высокое соотношение липид/белок. Белки составляют от 25 до 30 % массы сухого вещества миелиновой оболочки. Около 30 % всех белков миелина составляют три изоформы т. н. основного белка миелина (ОБМ). ОБМ является одним из основных аутоантигенов при РС. Ранее нами и другими исследователями было показано, что в деградации ОБМ могут принимать участие каталитические антитела , а также некоторые проте-
азы . Известно, что в любой эукариотической клетке существует специализированная органелла для направленной деградации белков - протеасома, представляющая собой высокомолекулярный белковый комплекс. Одной из функций протеасом является генерация пептидов, которые затем экспонируются на клеточной мембране с помощью молекул комплексов гистосовместимости (МНС) как первого, так и второго класса . Есть все основания полагать, что протеасома принимает непосредственное участие в процессе специфической деградации ОБМ. Детали этого механизма остаются невыясненными. В представленной работе нами были изучены особенности специфической деградации ОБМ протеасомой.
Известно, что 20S протеасома (мультикаталический протеиназный комплекс) - это олигомерная высокомолекулярная (700 кДа) протеиназа, которая может быть выделена индивидуально. Данный комплекс также является каталитическим ядром 26S протеасомы, в составе которой присутствуют одна или две регуляторных 19S субъединицы. Было показано, что и 20S и 26S протеасомы способны деградировать ОБМ . Вопрос о сайт-специфичности
BpeWR. МИНУТЫ
Рис. 1. Зависимость степени гидролиза ОБМ протеасомой от времени. Обозначения: о - 20S протеасома, - 26S протеасома, выделенные из печени аутбредных мышей
деградации ОБМ протеасомой оставался открытым. Кроме того, известно, что при многих воспалительных патологических процессах протеазный комплекс (конститутивная протеасома) переходит в форму иммунопротеасомы, обладающей альтернативной специфичностью и каталитической эффективностью по отношению к процессингу внутриклеточных белков. Скорее всего, это «переключение» имеет непосредственное отношению к различной презентации антигенов в норме и патологии. Паттерн деградации ОБМ иммунопротеасомой до настоящего времени изучен не был.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Протеасома была выделена и очищена по методу, описанному в . Сначала была исследована деградация ОБМ (изоформа с молекулярной массой 18.5 кДа из мозга быка) полным 26S комплексом и каталитической 20S субъединицей, выделенными из печени аутбредных мышей. Как показано на рис. 1, инкубация ОБМ как с 20S, так и с 26S протеасомой приводила к постепенной деградации ОБМ. Уже через 45 мин 20S протеасома полностью гидролизовала основной белок миелина, в то время как 26S протеасо-ме на это требовалось 85 мин. Такое различие в скоростях можно отнести к разному количеству протеасомы: в случае 20S протеасомы соотношение фермент/субстрат составило 2.7/1 (по белку, мкг/мкг) или 1/14.5 (моль/моль), а в случае 26S соотношение фермент/субстрат составило 1/1 (по белку, мкг/мкг) или 1/110 (моль/моль). Количество протеасомы оценивали по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.
Гидролизаты ОБМ, полученные под действием 20S и 26S комплексов из печени аутбредных мышей, были разделены на фракции методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С4 (Waters, DeltaPak, 300 А). Наблюдаются некоторые отличия в профилях элюции, в частности, в некоторых пиках, совпадающих для 20S и 26S протеасом, содержится разное количество вещества, кроме того, при гидролизе 26S протеасомой появляются новые фракции. Таким образом,
паттерн деградации ОБМ 26S протеасомой несколько изменен по сравнению с таковым для 20S протеасомы. Отмеченные различия можно объяснить разной доступностью для протеолиза участков ОБМ, находящихся на поверхности белковой глобулы и в глубине молекулы, а также имеющих выраженную вторичную структуру. Для 26S протеасомы доступность разных участков ОБМ не имеет большого значения, поскольку в составе 19S субчастицы есть субъединицы, отвечающие за денатурацию молекул белка, которые будут подвергнуты деградации.
Пул протеасом неоднороден и состоит из макромоле-кулярных комплексов нескольких типов, причем каталитические субъединицы могут относиться к т. н. конститутивным (ßl, ß2 и ß5) или иммунным (ßli, ß2i и ß5i) (рис. 2). Шесть каталитических субъединиц протеасомы обладают тремя типами активности, а именно: химотрипсино-подобной (гидролиз после гидрофобных и ароматических аминокислот Leu, Tyr, Phe), трипсиноподобной (гидролиз после положительно заряженных Lys и Arg) и каспазо-подобной (гидролиз после отрицательно заряженных Asp и Glu) .
Соотношение конститутивная протеасома/иммунопро-теасома имеет ярко выраженную тканеспецифичность и в значительной степени зависит от иммунного статуса организма. Так, например, в головном мозге в норме более 90 % протеасом - конститутивные, а в селезенке около 9095 % протеасом являются иммунопротеасомами. Кроме того, в любых тканях под действием гамма-интерферона интенсивно нарабатываются иммуносубъединицы, которые встраиваются во вновь собранные мультикаталити-ческие комплексы . Ранее было показано, что замены каталитических субъединиц на иммунные приводят к изменению специфичности гидролиза и увеличению его скорости. Иммунопротеасома практически теряет способность