Масс-спектрометры

Масс-спектрометрия (масс-спектроскопия, масс-спектрография, масс-спектральный анализ, масс-спектрометрический анализ) - метод исследования вещества, основанный на определении отношения массы к заряду ионов, образующихся при ионизации представляющих интерес компонентов пробы. Один из мощнейших способов качественной идентификации веществ, допускающий также и количественное определение. Можно сказать, что масс-спектрометрия - это «взвешивание» молекул, находящихся в пробе.

История масс-спектрометрии ведётся с основополагающих опытов Дж. Дж. Томсона в начале XX века. Окончание «-метрия» в названии метода появилось после повсеместного перехода от детектирования заряженных частиц при помощи фотопластинок к электрическим измерениям ионных токов.

Особенно широкое применение масс-спектрометрия находит в анализе органических веществ, поскольку обеспечивает уверенную идентификацию как относительно простых, так и сложных молекул. Единственное общее требование - чтобы молекула поддавалась ионизации. Однако к настоящему времени придумано столько способов ионизации компонентов пробы, что масс-спектрометрию можно считать практически всеохватным методом.

Почти все масс-спектрометры - это вакуумные приборы, поскольку ионы очень нестабильны в присутствии посторонних молекул. Однако существуют некоторые приборы, которые можно условно отнести к масс-спектрометрам, но в которых используется не вакуум, а поток особого чистого газа.

Масс-спектр - это зависимость интенсивности ионного тока (количества вещества) от отношения массы к заряду (природы вещества). Поскольку масса любой молекулы складывается из масс составляющих её атомов, масс-спектр всегда дискретен, хотя при низком разрешении масс-спектрометра пики разных масс могут перекрываться или даже сливаться. Природа анализируемого вещества, особенности метода ионизации и вторичные процессы в масс-спектрометре могут влиять на масс-спектр (см. метастабильные ионы, градиент ускоряющего напряжения по местам образования ионов, неупругое рассеивание). Так, ионы с одинаковыми отношениями массы к заряду могут оказаться в разных частях спектра и даже сделать часть его непрерывным.

Большинство небольших молекул при ионизации приобретает только один положительный или отрицательный заряд. Чем больше молекула, тем больше вероятность того, что во время ионизации она превратится в многозарядный ион. Поэтому особенно сильно данный эффект проявляется в отношении крайне больших молекул, например, белков, нуклеиновых кислот и полимеров. При некоторых видах ионизации (например, электронный удар) молекула может распадаться на несколько характерных частей, что даёт дополнительные возможности идентификации и исследования структуры неизвестных веществ.

Точное определение массы анализируемой молекулы позволяет определить её элементный состав (см.: элементный анализ). Масс-спектрометрия также позволяет получить важную информацию об изотопном составе анализируемых молекул.

История масс-спектрометрии

1912 год - Дж. Дж. Томсон создает первый масс-спектрограф и получает масс-спектры молекул кислорода, азота, угарного газа, углекислого газа и фосгена.
1913 год - С помощью своего масс-спектрографа Дж. Дж. Томсон открывает изотопы неона: неон-20 и неон-22.
1918 год - Артур Демпстер строит первый масс-спектрограф.
1919 год - Фрэнсис Астон, независимо от Демпстера, строит свой первый масс-спектрограф и начинает исследования изотопов. Этот прибор имел разрешающую способность около 130.
1923 год - Астон измеряет с помощью масс-спектрометра дефект массы.
1932 год - Кеннет Бейнбридж строит масс-спектрометр с разрешающей способностью 600 и чувствительностью 1 часть на 10 тыс.
1936 год - Артур Демпстер, Кеннет Бэйнбридж (англ. Kenneth Tompkins Bainbridge) и Йозеф Маттаух (англ. Josef Heinrich Elizabeth Mattauch) конструируют масс-спектрограф с двойной фокусировкой. Демпстер разрабатывает искровой источник ионизации.
1940 год - Альфред Нир с помощью препаративной масс-спектрометрии выделяет уран-235.
1940 год - Альфред Нир создает первый надёжный источник электронного удара, применив ионизационную камеру.
1942 год - Лоуренс запускает «калутрон» - промышленную установку по разделению изотопов урана, основанную на магнитно-секторном масс-спектрометре.
1946 год - Уильям Стивенс предлагает концепцию время-пролётного масс-спектрометра.
1948 год - Камероном и Эггерсом создан первый масс-спектрометр с время-пролётным масс-анализатором.
1952 год - Тальрозе и Любимова впервые наблюдают сигнал метония CH5+ в ионном источнике электронного удара при повышенном давлении метана в ионизационной камере (в 1966 Мансон и Филд применят это открытие для аналитических целей и создадут ионный источник с химической ионизацией).
1953 год - Пауль патентует квадрупольный масс-анализатор и ионную ловушку.
1956 год - МакЛафферти и Голке создают первый газовый хромато-масс-спектрометр.
1966 год - Мансон и Филд создают ионный источник с химической ионизацией.
1972 год - Каратаев и Мамырин изобретают время-пролётный масс-анализатор с фокусировкой, значительно улучшающий разрешение анализатора.
1974 год - Первый жидкостный хромато-масс-спектрометр создан Арпино, Болдуином и МакЛафферти
1981 год - Барбер, Бордоли, Седжвик и Тайлор создают ионизатор с бомбардировкой быстрыми атомами (FAB).
1982 год - Первый масс-спектр целого белка (инсулин) с помощью бомбардировки быстрыми атомами (FAB).
1983 год - Бланки и Бестал изобретают термоспрей.
1984 год - Л. Н. Галль, а затем Фенн публикуют работы по методу электроспрей.
1987 год - Карас, Бахман, Бар и Хилленкамп изобретают ионизацию лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI).
1999 год - Александр Макаров (англ.)русск. изобретает электростатическую ионную ловушку «Орбитрэп».

Принцип работы и устройство масс-спектрометра

Источники ионов

Первое, что надо сделать для того, чтобы получить масс-спектр, - превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы - ионы. Этот процесс называется ионизацией и по-разному осуществляется для органических и неорганических веществ. Вторым необходимым условием является перевод ионов в газовую фазу в вакуумной части масс спектрометра. Глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра, а при его отсутствии ионы рассеются и рекомбинируют (превратятся обратно в незаряженные частицы).

Условно способы ионизации органических веществ можно классифицировать по фазам, в которых находятся вещества перед ионизацией.

Газовая фаза электронная ионизация (EI) химическая ионизация (CI) электронный захват (EC) ионизация в электрическом поле (FI) Жидкая фаза термоспрей ионизация при атмосферном давлении (AP)

электроспрей (APESI)
химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)
фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)

Твёрдая фаза прямая лазерная десорбция - масс-спектрометрия (LDMS) матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS) бомбардировка быстрыми атомами (FAB) десорбция в электрическом поле (FD) плазменная десорбция (PD)

В неорганической химии для анализа элементного состава применяются жёсткие методы ионизации, так как энергии связи атомов в твёрдом теле гораздо больше и значительно более жёсткие методы необходимо использовать для того, чтобы разорвать эти связи и получить ионы.

ионизация в индуктивно-связанной плазме (ICP)
термоионизация или поверхностная ионизация
ионизация в тлеющем разряде и искровая ионизация (см. искровой разряд)
ионизация в процессе лазерной абляции

Исторически первые методы ионизации были разработаны для газовой фазы. К сожалению, очень многие органические вещества невозможно испарить, то есть перевести в газовую фазу, без разложения. А это значит, что их нельзя ионизовать электронным ударом. Но среди таких веществ почти всё, что составляет живую ткань (белки, ДНК и т. д.), физиологически активные вещества, полимеры, то есть всё то, что сегодня представляет особый интерес. Масс-спектрометрия не стояла на месте и последние годы были разработаны специальные методы ионизации таких органических соединений. Сегодня используются, в основном, два из них - ионизация при атмосферном давлении и её подвиды - электроспрей (ESI), химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI) и фотоионизация при атмосферном давлении (APPI), а также ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI).

Масс-анализаторы

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап масс- спектрометрического анализа - сортировка ионов по массам (точнее по отношению массы к заряду, или m/z). Существуют следующие типы масс-анализаторов:

Непрерывные масс-анализаторы

Магнитный и электростатический секторный масс-анализатор (англ. Sector instrument)
Квадрупольный масс-анализатор (англ. Quadrupole mass analyzer)

импульсные масс-анализаторы

Времяпролётный масс-анализатор (англ. Time-of-flight mass spectrometry)
Ионная ловушка (англ. Ion trap)
Квадрупольная линейная ловушка (англ. Quadrupole ion trap)
Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (англ. Fourier transform ion cyclotron resonance)
Орбитрэп (англ. Orbitrap)

Разница между непрерывными и импульсными масс-анализаторами заключается в том, что в первых ионы поступают непрерывным потоком, а во вторых - порциями, через определённые интервалы времени.

Масс-спектрометр может иметь два масс-анализатора. Такой масс-спектрометр называют тандемным. Тандемные масс спектрометры применяются, как правило, вместе с «мягкими» методами ионизации, при которых не происходит фрагментации ионов анализируемых молекул (молекулярных ионов). Таким образом первый масс-анализатор анализирует молекулярные ионы. Покидая первый масс-анализатор, молекулярные ионы фрагментируются под действием соударений с молекулами инертного газа или излучения лазера, после чего их фрагменты анализируются во втором масс-анализаторе. Наиболее распространёнными конфигурациями тандемных масс спектрометров являются квадруполь-квадрупольная и квадруполь-времяпролётная.

Детекторы

Последним элементом описываемого нами упрощённого масс-спектрометра, является детектор заряженных частиц. Первые масс-спектрометры использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод, выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него ещё большее количество электронов и т. д. Другой вариант - фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора. Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея).

Хромато-масс-спектрометрия

Масс-спектрометры используются для анализа органических и неорганических соединений.

Органические вещества в большинстве случаев представляют собой многокомпонентные смеси индивидуальных компонентов. Например, показано, что запах жареной курицы составляют 400 компонентов (то есть, 400 индивидуальных органических соединений). Задача аналитики состоит в том, чтобы определить сколько компонентов составляют органическое вещество, узнать какие это компоненты (идентифицировать их) и узнать сколько каждого соединения содержится в смеси. Для этого идеальным является сочетание хроматографии с масс-спектрометрией. Газовая хроматография как нельзя лучше подходит для сочетания с ионным источником масс-спектрометра с ионизацией электронным ударом или химической ионизацией, поскольку в колонке хроматографа соединения уже находятся в газовой фазе. Приборы, в которых масс-спектрометрический детектор скомбинирован с газовым хроматографом, называются хромато-масс-спектрометрами («Хромасс»).

Многие органические соединения невозможно разделить на компоненты с помощью газовой хроматографии, но можно с помощью жидкостной хроматографии. Для сочетания жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией сегодня используют источники ионизации в электроспрее (ESI) и химической ионизации при атмосферном давлении (APCI), а комбинацию жидкостных хроматографов с масс-спектрометрами называют ЖХ/МС (англ. LC/MS). Самые мощные системы для органического анализа, востребованные современной протеомикой, строятся на основе сверхпроводящего магнита и работают по принципу ионно-циклотронного резонанса. Они также носят название FT/MS, поскольку в них используется Фурье преобразование сигнала.

Характеристики масс-спектрометров и масс-спектрометрических детекторов

Важнейшими техническими характеристиками масс-спектрометров являются чувствительность, динамический диапазон, разрешение, скорость сканирования.

По характеристике сочетания чувствительности с достоверностью определения компонентов следом за приборами высокого разрешения идут ионные ловушки. Классические квадрупольные приборы нового поколения имеют улучшенные характеристики благодаря ряду инноваций, применённых в них, например, использованию искривлённого квадрупольного префильтра, предотвращающего попадание нейтральных частиц на детектор и, следовательно, снижению шума.

Применения масс-спектрометрии

Разработка новых лекарственных средств для спасения человека от ранее неизлечимых болезней и контроль производства лекарств, генная инженерия и биохимия, протеомика. Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ.

Выяснение источника происхождения очень важно для решения целого ряда вопросов: например, определение происхождения взрывчатых веществ помогает найти террористов, наркотиков - бороться с их распространением и перекрывать пути их трафика. Экономическая безопасность страны более надёжна, если таможенные службы могут не только подтверждать анализами в сомнительных случаях страну происхождения товара, но и его соответствие заявленному виду и качеству. А анализ нефти и нефтепродуктов нужен не только для оптимизации процессов переработки нефти или геологам для поиска новых нефтяных полей, но и для того, чтобы определить виновных в разливах нефтяных пятен в океане или на земле.

В эпоху «химизации сельского хозяйства» весьма важным стал вопрос о присутствии следовых количеств применяемых химических средств (например, пестицидов) в пищевых продуктах. В мизерных количествах эти вещества могут нанести непоправимый вред здоровью человека.

Целый ряд техногенных (то есть не существующих в природе, а появившихся в результате индустриальной деятельности человека) веществ являются супертоксикантами (имеющими отравляющее, канцерогенное или вредное для здоровья человека действие в предельно низких концентрациях). Примером является хорошо известный диоксин.

Существование ядерной энергетики немыслимо без масс-спектрометрии. С её помощью определяется степень обогащения расщепляющихся материалов и их чистота.

Трудно представить область человеческой деятельности, где не нашлось бы места масс-спектрометрии. Ограничимся просто перечислением: аналитическая химия, биохимия, клиническая химия, общая химия и органическая химия, фармацевтика, косметика, парфюмерия, пищевая промышленность, химический синтез, нефтехимия и нефтепераработка, контроль окружающей среды, производство полимеров и пластиков, медицина и токсикология, криминалистика, допинговый контроль, контроль наркотических средств, контроль алкогольных напитков, геохимия, геология, гидрология, петрография, минералогия, геохронология, археология, ядерная промышленность и энергетика, полупроводниковая промышленность, металлургия.

Что происходит с образцами крови, которую вы сдаете на клинический анализ? Сколько весит ваш гемоглобин? Каким образом ученые вообще взвешивают молекулы - мельчайшие частицы вещества, которые невозможно увидеть или потрогать? Обо всем этом в рамках рубрики «Просто о сложном» T&P рассказала студентка 5-го курса кафедры химической физики ФМХФ, сотрудница лаборатории ионной и молекулярной физики МФТИ Екатерина Жданова.

Очень часто методы исследований интересуют лишь специалистов в конкретных областях и остаются в тени более фундаментальных проблем, например происхождения жизни или принципов работы человеческого сознания. Тем не менее для поиска ответа на «главный вопрос жизни, Вселенной и всего остального» сначала необходимо научиться отвечать на вопросы более простые. Например, как взвесить молекулу?   Обычные весы тут вряд ли помогут: масса молекулы метана - около 10^(-23) грамм. Молекула гемоглобина, крупного и сложного белка, весит в несколько раз больше - 10^(-20) грамм. Ясно, что необходим какой-то иной подход к проблеме, ведь привычные нам измерительные приборы к ней не применимы. Надо также понимать, что, взвешивая в магазине яблоки или становясь на весы после тренировок, мы на самом деле измеряем силу, действующую на прибор - весы. Затем уже происходит пересчет в привычные нам единицы - граммы и килограммы. 

Но как же взвесить молекулу? Здесь природа оставила нам лазейку. Оказывается, заряженные частицы «чувствуют» присутствие электрического и магнитного поля и изменяют траекторию и характер своего движения. На заряженные частицы также действуют силы, величину которых можно пересчитать в отношении массы к заряду. Этот метод сегодня довольно популярен и называется масс-спектрометрия. Первооткрывателем масс-спектрометрии считается сэр Дж. Дж. Томсон, нобелевский лауреат по физике. Он обратил внимание на то, что заряженные частицы движутся в магнитном поле по параболическим траекториям, пропорциональным отношению их массы к заряду.

Схема работы масс-спектрометра состоит из нескольких этапов. Прежде всего анализируемое вещество должно пройти ионизацию. Затем оно попадает в систему ионного транспорта, которая должна доставить заряженные частицы в масс-анализатор. В масс-анализаторе как раз происходит разделение ионов в зависимости от отношения массы к заряду. В завершение ионы попадают на детектор, данные с которого анализируются с помощью специального программного обеспечения. Полученная таким образом картинка представляет собой спектр, то есть распределение частиц. Одна из осей этого графика - отношения массы к заряду, вторая - интенсивность. Каждый из пиков на таком графике будет характерным для ионов конкретного вещества, поэтому попадание в прибор посторонних веществ, например воздуха, может привести к искажениям результатов. Чтобы избежать этого, применяется вакуумная система.

Сравнительно простая физическая концепция данного метода требует ряда нетривиальных инженерных решений. Как ионизировать молекулы? Каким способом создавать электромагнитное поле?  Атомы и молекулы электрически нейтральны, поэтому для проведения масс-спектрометрических измерений необходимо их ионизировать, то есть оторвать электроны с внешних атомных орбиталей или добавить протон. Важную роль играет тип образца, с которым предстоит работать. Для исследования неорганических веществ - металлов, сплавов, горных пород - необходимо использовать одни методы, для органических веществ подходят другие. Очень многие органические вещества (такие как ДНК или полимеры) сложно испарить, то есть перевести в газ, без разложения, а это значит, что исследования живой ткани или биологических образцов требуют применения специальных методов. Кроме того, при ионизации молекулы могут распадаться на отдельные фрагменты. Так мы снова встаем перед вопросом: что именно мы собираемся измерить? Массу всей молекулы или массу фрагментов? И то и другое важно. Более того, измерив массу целой молекулы, исследователи часто специально дробят ее на куски. Так, определив массу структурных элементов белка, мы вместе с тем определяем и их количество, что позволяет нам делать выводы о его химическом составе и структуре.

Все это говорит о разнообразии существующих масс-спектрометров, каждый из которых применяется для решения задач в конкретной области. Этот метод практически незаменим в тех случаях, когда ученым необходимо определить химический состав вещества. Фармацевты применяют масс-спектрометрические эксперименты при разработке лекарств, исследованиях фармакокинетики (то есть биохимических процессов, происходящих в организме при принятии лекарства) и метаболизма. Ученые-биологи используют масс-спектрометрию для анализа белков, пептидов и нуклеиновых кислот. Кроме того, если мы хотим проверить качество воды или продуктов питания, то нам снова не обойтись без этого метода.

Отдельная инновационная область применения масс-спектрометрии - медицинская диагностика. К развитию множества заболеваний приводят структурные изменения белков нашего организма: обычно они классифицируются по образованию характерного кусочка, пептида-маркера. Если вовремя определить такую мутацию, то появляется возможность лечить болезнь на ранней стадии. Кроме того, благодаря современным масс-спектрометрам становится возможным проводить исследования такого рода в режиме реального времени - например, в ходе нейрохирургической операции. Это позволяет точно определять границы между здоровой тканью и опухолью, что критически важно для хирургов.

Кажущаяся на первый взгляд сухой и узкопрофильной, масс-спектрометрия при внимательном ознакомлении оказывается удивительно богатой областью, объединяющей широкий класс приложений с необычными инженерными решениями. Наука показывает, что ответы на менее фундаментальные вопросы порой не менее интересны.

ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Химический факультет

Курсовая работа на тему
«Масс-спектрометрический метод анализа»

Выполнил: студент группы Х-202
Меньшенин А.Н.

Проверила: Данилина Е.И.

Линейная ионная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вдоль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиочастотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основное преимущество линейной ловушки перед 3D – больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и улучшает диапазон количественного анализа.
Ограничения ионной ловушки: сканирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамический диапазон.

Главными ограничениями данных возможностей ионной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным средством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способность давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупольного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средним затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношения между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента составляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюстрацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не будут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничения на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушки пространственные влияние зарядов ограничит представительность анализатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число вошедших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопровождается большим фоном других ионов.

Двуфокусирующий магнитный сектор

Первые анализаторы масс разделяли ионы при помощи магнитного поля. В магнитом анализе ионы ускоряются в магнитном поле при помощи электрического. Заряженные частицы, движущиеся в магнитно поле, будут двигаться по дуге, радиус которой зависит от скорости ион, силы магнитного поля и m / z иона. Масс-спектр получается сканированием магнитного поля и наблюдением того, как ионы попадают фиксированный точечный детектор. Ограничением магнитных анализаторов является относительно малое разрешение. Чтобы улучшить его, магнитные приборы были модифицированы с добавлением электростатического анализатора, чтобы сфокусировать ионы. Такие приборы называются двухсекторными. Электрический сектор служит как элемент фокусировки кинетической энергии, позволяя только ионам с определённой кинетической энергией проходить через поле, независимо от их m / z отношения. То есть, добавление электрического сектора позволяет только ионам с одинаковой энергией достигать детектора, тем самым уменьшая разброс кинетической энергии, что, в свою очередь, увеличивает разрешение. Нужно отметить, что увеличение разрешения вызывает соответствующее уменьшение чувствительности. Такие двуфокусирующие (рис. 2.7) анализаторы масс используются совместно с ESI, FAB и EI, однако они нешироко используются сейчас, в основном, из-за их больших размеров и успешности времяпролётных, квадрупольных и FTMS анализаторов с ESI и

MALDI.

Квадрупольная-времяпролётная тандемная масс-спектрометрия

Линейный времяпролётный (TOF) анализатор масс (рис. 2.7 ) является простейшим анализатором масс. Он пережил возрождение с изобретением MALDI и его текущее применения для электроспрея и даже газовой хроматографии с масс-спектрометрией электронной ионизацией (GC/MS). Времяпролётный анализ основан на ускорении группы ионов по направлению к детектору, при котором всем ионам сообщается одинаковая энергия при помощи ускоряющего потенциала. Так как ионы имеют одинаковую энергию, но разную массу, лёгкие ионы достигают детектора первыми из-за их большей скорости, в то время как тяжёлые ионы летят дольше из-за их большей массы и, соответственно, более низкой скорости. Поэтому анализатор был назван времяпролётным, потому что масса в нём определяется по времени прибытия ионов. Масса, заряд и кинетическая энергия – всё это вносит свой в клад в время прибытия иона к детектору. Так как кинетическая энергия (KE) иона равна ½ mv 2 , скорость иона может быть представлена как v = d/t = (2KE/m) ½ . Ионы проходят расстояние d за время t, а t зависит от m / z . В этом уравнении v = d/t = (2KE/m) ½ , принимая z = 1. Другим представлением этого уравнения, более чётко показывающим, как определяется масса, является m=2t 2 KE/d 2 , где KE=const .

Времяпролётный рефлектрон (рис. 2.8 ) сейчас широко используется для ESI, MALDI, а в последнее время и для приложения электронной ионизации для ГХ/МС. Он комбинирует времяпролётную технологию и электростатическое зеркало. Рефлектрон служит для увеличения времени (t), которое нужно ионам, чтобы достичь детектора, при этом уменьшая распределение кинетической энергии, тем самым уменьшая временное распределение Δt. Так как разрешение определяется как масса пика, делённая на его ширину или m/Δm (или t/Δt, так как m пропорциональна t), увеличение t и уменьшение Δt приводит к росту разрешения. Поэтому TOF рефлектрон даёт более высокое разрешение по сравнению с простым прибором TOF посредством увеличения длины пути и фокусировки энергии посредством рефлектрона. Нужно отметить, что увеличенное разрешение (обычно выше 5000) и чувствительность на TOF рефлектроне значительно уменьшается при высоких массах (обычно при m / z свыше 5000).

Другим типом тандемного анализа масс, MS/MS, является также возможное комбинирование MALDI и TOF рефлектрона. MS/MS осуществляется с особенности MALDI – фрагментации, которая происходит после ионизации, или распадом после источника (PSD). Времяпролётные приборы сами по себе не разделяют пост-ионизационные фрагментарные ионы от одного и того же иона-прекурсора, потому что и прекурсор, и фрагментарные ионы имеют одинаковую скорость и поэтому достигают детектора в одно и то же время. Рефлектрон даёт преимущество в том, что фрагментарные ионы имеют разную кинетические энергии и разделяются на основании того, как глубоко ионы проникают в поле рефлектрона, тем самым давая спектр фрагментарных ионов (рис. 2.9 и 2.10 ).

Нужно заметить, что электроспрей также был адаптирован под TOF рефлектронные анализаторы, в которых ионы из непрерывного ESI-источника накапливаются в гексаполярном (или октаполярном) ионопроводе, а затем выталкиваются в TOF анализатор. Тем самым, необходимая электростатическая импульсность создаёт точку отсчёта, с которой можно начинать измерения TOF.

MALDI и времяпролётный анализ

На начальных этапах развития MALDI-TOF, эти приборы имели относительно низкое разрешение, которое серьёзно ограничивало их точность. Нововведением, которое оказало существенный эффект на увеличение разрешающей силы MALDI времяпролётных приборов было отложенное извлечение (DE), как показано на рис. 2.11 . В теории, отложенное извлечение означает просто охлаждение и фокусировку ионов сразу после акта MALDI, но на практике сначала было проблемой включать и выключать импульсы в 10000 вольт за наносекунды.

В традиционных приборах MALDI, ионы ускоряются из устройства ионизации сразу после образования. Однако, отложенное извлечение ионов позволяет им «остыть» в течение ~150 наносекунд перед ускорением в анализатор. Этот период охлаждения генерирует набор ионов с гораздо меньшим распределением кинетической энергии, значительно уменьшая временной разброс ионов, когда они входят в TOF анализатор. В общем, это приводит к увеличению разрешения и точности. Выгоды отложенного извлечения значительно сокращаются для больших макромолекул, таких как белки (>30000 Да).

Квадрупольная времяпролётная масс-спектрометрия

Квадрупольные времяпролётные анализаторы масс обычно совмещаются с устройствами ионизации электроспрея, а в последнее время успешно совмещаются с MALDI. ESIquad-TOF (рис. 2.12 ) комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой эффективностью, чувствительностью и точностью времяпролётного рефлектронного анализатора масс. Квадруполь может выступать как простой квадрупольный анализатор, чтобы сканировать определённый диапазон m / z . Однако он может быть также использован, чтобы селективно выделить ион-прекурсор и направить его в ячейку столкновения. Получившиеся фрагментарные ионы затем анализируются TOF рефлектронным анализатором масс. Квадрупольный TOF использует способность квадруполя выделять отдельный ион и способность TOF-MS совершать одновременное и точное измерение ионов по всему диапазону масс за короткий период времени. Квадрупольные TOF анализаторы выдают большую чувствительность и точность, нежели тандемные квадрупольные приборы при получении полных фрагментарных масс-спектров.

Квадрупольный TOF прибор может использовать квадрупольный или TOF анализаторы независимо или совместно для тандемных MSэкспериментов. TOF компонент прибора имеет больший m / z предел, превышающий 10000. Высокая разрешающая сила (~10000) TOF также обеспечивает хорошую точность измерения массы – порядка 10 ppm. Из-за своей высокой точности и чувствительности, ESIquad-TOF масс-спектрометр внедряются в решение проблем протеомики и фармакокинетики.

Масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (FTMS)

FTMS основана на принципе наблюдения за орбитальным движением заряженных частиц в магнитном поле (рис. 2.13-14 ). Пока ионы движутся по орбитам, импульсный радиочастотный (RF) сигнал используется для их возбуждения. Это RF возбуждение позволяет ионам продуцировать заметный экранирующий ток, вводя их в когерентное движение и увеличивая радиус орбиты. Экранирующий ток, генерируемый всеми ионами, может быть затем Фурье-преобразован, чтобы получить составляющие частоты различных ионов, которые соотносятся с их m / z . Так как частоты могут быть определены с высокой точностью, соответствующие им m / z также могут быть вычислены с высокой точностью. Важно отметить, что сигнал генерируется только когерентным движением ионов в условиях ультравысокого вакуума (10 -11 -10 -9 Торр). Этот сигнал должен быть измерен за минимальное время (обычно от 500 мс до 1 секунды), чтобы обеспечить высокое разрешение. По мере увеличения давления, сигнал затухает быстрее, вследствие потери когерентности движения из-за столкновений (например, меньше чем за 150 мс) и не позволяет провести измерения с высоким разрешением (рис. 2.14 ).

Ионы, находящиеся в когерентном циклотронном движении между двумя электродами изображено на рис. 2.13 . По мере того, как положительно заряженные ионы двигаются от верхнего электрона и приближаются к нижнему, электрическое поле ионов вынуждает электроны внешней цепи течь и накапливаться на нижнем электроде. На другой половине циклотронной орбиты электроны покидают нижний электрод и накапливаются на верхнем электроде, когда ионы приближаются. Колебательное движение электронов внешней цепи называется экранирующим током. Когда смесь ионов с различными значениями m / z одновременно ускоряется, сигнал экранирующего тока на выходе усилителя представляет собой составной установившийся сигнал с составляющими частотам, соответствующими каждому значению m / z . Проще говоря, все ионы, запертые в ячейке анализатора, возбуждаются до высоких циклотронных орбит при помощи радиочастотного импульса. Составной установившийся сигнал экранирующего тока ионов по мере их релаксации обрабатывается компьютером, и используется преобразование Фурье для выделения индивидуальных циклотронных частот. Влияние давления на сигнал и разрешение продемонстрировано на рис. 2.14.

Вдобавок к высокому разрешению, FTMS также обладает способностью обеспечивать эксперименты с многократными столкновениями (MS n). FTMS способна к исключению всех ионов, кроме нужного. Выделенный ион затем подвергается столкновению с газом (или другой форме возбуждения: лазерному облучению или электронному захвату) для вызывания фрагментации. Анализ масс может быть затем проведён для фрагментов, чтобы получить спектр фрагментации. Высокое разрешение FTMS/MS также даёт точные измерения масс фрагментов.

FTMS является довольно новым методом для биомолекулярного анализа, но множество её преимуществ делают её всё более и более интересной. Сейчас становится всё более обычным объединение ультравысокого разрешения (>10 5) FTMS с большим разнообразием способов ионизации, включая MALDI, ESI, APCI и EI. Результатом высокой разрешающей способности FTMS анализатора является высокая точность (часто порядка долей ppm) как показано для белка на рис. 2.16 , где можно видеть отдельные пики изотопов. Фурье преобразование сигнала ICR значительно увеличивает удобство ICR за счёт одновременного измерения перекрывающихся частот, произведённых внутри ячейки ICR. Индивидуальные частоты могут быть затем легко и точно переведены в m / z ионов.

В общем, увеличение магнитного поля (B) оказывает благоприятный эффект на характеристики. Фурье преобразование IRC сигнала, измеряя перекрывающиеся частоты одновременно, позволяет достичь высокого разрешения и большой точности определения масс без соответствующего уменьшения чувствительности. Это – чёткое отличие от двухсекторными приборами, которые подвержены потерям чувствительности при высочайших разрешении и точности. Высокие возможности разрешения FTMS прямо связаны с полем FTMS сверхпроводящего магнита, так как увеличение разрешения прямо пропорционально полю. Ионная вместимость, так же как MS/MS эксперименты по кинетической скорости увеличиваются пропорционально квадрату величины поля, тем самым увеличивая динамический диапазон и фрагментарную информацию. Одним из препятствий в увеличении B является эффект магнитного зеркала, когда перенос ионов внутрь магнитного поля становится всё более трудным из-за магнитных силовых линий. Также, изготовление высокопольных магнитов с большими отверстиями превосходной гомогенностью поля (для IRC) становится технически всё более сложным.

Магнитное поле влияет на FTMS оборудование следующими путями :

Так как частота иона = K*B*z/m, большее магнитное поле обеспечивает большую частоту для того же m / z , поэтому генерируется больше опорных точек для более точного определения частоты, что ещё больше увеличивает точность (рис. 2.17 ).

Квадрупольная FTMS и квадрупольной ионной ловушки FTMS анализаторы масс, которые в последнее время стали использоваться, обычно объединяются с ESI устройствами. Квадрупольная FTMS комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой точностью FTMS. Квадруполь может действовать как любой простой квадрупольный анализатор для сканирования по диапазону m / z . Однако он также может быть использован для селективного избирания иона-прекурсора и направления этого иона в ячейку столкновений или на FTMS. Полученные прекурсор и фрагментарные ионы могут быть затем анализированы при помощи FTMS.

Проведение MS/MS экспериментов вне магнитного поля предоставляет некоторые преимущества, так как высокое разрешение в FTMS зависит от высокого вакуума. MS/MS эксперименты включают в себя столкновения при установившемся высоком давлении (10 -6 – 10 -7 Торр), которое затем необходимо уменьшить, чтобы добиться высокого разрешения (10 -10 – 10 -9 Торр). Проведение MS/MS экспериментов вне ячейки, тем самым, оказывается быстрее, так как в IRC ячейке может поддерживаться ультравысокий вакуум. Это делает более новую гибридную компоновку прибора оптимальной по сравнению с комбинацией FTMS/MS с методами разделения, такими как ЖХ.

Таблица 2.2. Общее сравнение анализаторов масс, обычно используемых совместно с ESI. Эти значения могут меняться в зависимости от производителя прибора.

Квадрупольный	Ионная ловушка	Времяпролётный	Времяпролётный рефлектрон	Магнитный сектор	FTMS	Квадрупольный TOF
Точность	0.01% (100 ppm)	0.01% (100 ppm)	0.02 to 0.2% (200 ppm)	0.001% (10 ppm)	<0.0005% (<5 ppm)	<0.0005% (<5 ppm)	0.001% (10 ppm)
Разрешение	4,000	4,000	8,000	15,000	30,000	100,000	10,000
Диапазон m/z	4,000	4,000	>300,000	10,000	10,000	10,000	10,000
Скорость сканирования	~ секунда	~ секунда	миллисекунды	миллисекунды	~ секунда	~ секунда	~ секунда
Тандемная MS	MS 2 (тройной квадруполь)	MS n	MS	MS 2	MS 2	MS n	MS 2

(масс-сиектроскопия, масс-спектрография, масс-спектральный анализ, масс-спектрометрический анализ) – метод исследования вещества путем определения отношения массы к заряду (качества) и количества заряженных частиц, образующихся при том или ином процессе воздействия на вещество. История масс-спектрометрии ведется с основополагающих опытов Джона Томсона в начале XX в. Окончание "-метрия" термин получил после повсеместного перехода от детектирования заряженных частиц при помощи фотопластинок к электрическим измерениям ионных токов.

Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия непосредственно детектирует сами частицы вещества (рис. 6.12).

Рис. 6.12.

Масс-спектрометрия в широком смысле – это наука получения и интерпретации масс-спектров, которые, в свою очередь, получаются при помощи масс-спектрометров.

Масс-спектрометр – это вакуумный прибор, использующий физические законы движения заряженных частиц в магнитных и электрических полях, необходимый для получения масс-спектра.

Масс-спектр, как и любой спектр, в узком смысле – это зависимость интенсивности ионного тока (количества) от отношения массы к заряду (качества). Ввиду квантования массы и заряда типичный масс-спектр является дискретным. Обычно (в рутинных анализах) так оно и есть, но не всегда. Природа анализируемого вещества, особенности метода ионизации, и вторичные процессы в масс-спектрометре могут оставлять свой след в масс-спектре. Так, ионы с одинаковыми отношениями массы к заряду могут оказаться в разных частях спектра и даже сделать часть его непрерывным. Поэтому масс-спектр в широком смысле – это нечто большее, несущее специфическую информацию и делающее процесс его интерпретации более сложным и увлекательным. Ионы бывают однозарядные и многозарядные, причем как органические, так и неорганические. Большинство небольших молекул при ионизации приобретает только один положительный или отрицательный заряд. Атомы способны приобретать более одного положительного заряда и только один отрицательный. Белки, нуклеиновые кислоты и другие полимеры способны приобретать множественные положительные и отрицательные заряды. Атомы химических элементов имеют специфическую массу. Таким образом, точное определение массы анализируемой молекулы позволяет установить ее элементный состав. Масс-спектрометрия также позволяет получить важную информацию об изотопном составе анализируемых молекул. В органических веществах молекулы представляют собой определенные структуры, образованные атомами. Природа и человек создали поистине неисчислимое многообразие органических соединений. Современные масс-спектрометры способны фрагментировать детектируемые ионы и определять массу полученных фрагментов. Таким образом можно получать данные о структуре вещества.

Принцип работы масс-спектрометра

Приборы, которые используются в масс-спектрометрии, называются масс-спектрометры или масс-спектрометрические детекторы. Эти приборы работают с материальным веществом, которое состоит из мельчайших частиц – молекул и атомов. Масс-спектрометры устанавливают, что это за молекулы (т.е. какие атомы их составляют, какова их молекулярная масса, какова структура их расположения) и что это за атомы (т.е. их изотопный состав). Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества. Масс-спектрометрия измеряет их массы, вернее, соотношение массы к заряду. Для этого используются законы движения заряженных частиц материи в магнитном или электрическом поле. Масс-спектр – это рассортировка заряженных частиц по их массам (отношениям массы к заряду).

Во-первых, для того чтобы получить масс-спектр, необходимо превратить нейтральные молекулы и атомы, составляющие любое органическое или неорганическое вещество, в заряженные частицы – ионы. Этот процесс называется ионизацией и по-разному осуществляется для органических и неорганических веществ. В органических веществах молекулы представляют собой определенные структуры, образованные атомами.

Во-вторых, необходимо перевести ионы в газовую фазу в вакуумной части масс-спектрометра. Глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри масс-спектрометра, а при его отсутствии ионы рассеются и рекомбинируют (превратятся обратно в незаряженные частицы).

Газовая фаза:

электронная ионизация (ЭИ, El – Electron ionization);
химическая ионизация (ХИ, Cl – Chemical Ionization);
электронный захват (ЭЗ, ЕС – Electron capture);
ионизация в электрическом поле (ПИ, FI – Field ionization).

Жидкая фаза:

термоспрей;
ионизация при атмосферном давлении (АДИ, АР – Atmospheric Pressure Ionization);
электроспрей (ЭС, ESI – Electrospray ionization);
химическая ионизация при атмосферном давлении (ХИАД, APCI – Atmospheric pressure chemical ionization);
– фотоионизация при атмосферном давлении (ФИАД, APPI – Atmospheric pressure fotoionization).

Твердая фаза:

прямая лазерная десорбция – масс-спектрометрия (ПЛДМС, LDMS – Direct Laser Desorption – Mass Spectrometry);
матрично-активированная лазерная десорбция (ионизация) (МАЛДИ, MALDI – Matrix Assisted Laser Desorbtion (Ionization));
масс-спектрометрия вторичных ионов (МСВИ, SIMS – Secondary-Ion Mass Spectrometry);
бомбардировка быстрыми атомами (ББА, FAB – Fast Atom Bombardment);
десорбция в электрическом поле (ПД, FD – Field Desorption);
плазменная десорбция (ПД, PD – Plasma desorption).

В неорганической химии для анализа элементного состава

применяются жесткие методы ионизации, так как энергии связи атомов в твердом теле гораздо больше, значит, и значительно более жесткие методы необходимо использовать для того, чтобы разорвать эти связи и получить ионы:

ионизация в индуктивно-связанной плазме (ИСП, IC – Pinductively coupled plasma);
термоионизация или поверхностная ионизация;
ионизация в тлеющем разряде и искровая ионизация;
ионизация в процессе лазерной абляции.

Исторически первые методы ионизации были разработаны для газовой фазы. К сожалению, очень многие органические вещества невозможно испарить, т.е. перевести в газовую фазу, без разложения. А это значит, что их нельзя ионизовать электронным ударом. Но среди таких веществ почти все, что составляет живую ткань (белки, ДНК и т.д.), физиологически активные вещества, полимеры, т.е. все то, что сегодня представляет особый интерес. Масс-спектрометрия не стояла на месте и в последние годы были разработаны специальные методы ионизации таких органических соединений. Сегодня используются в основном два из них – ионизация при атмосферном давлении и ее подвиды – электроспрей (ЭС), химическая ионизация при атмосферном давлении и фотоионизация при атмосферном давлении, а также ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (МАЛДИ).

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап масс-спсктромстричсского анализа – сортировка ионов по массам (точнее, по отношению массы к заряду).

Существуют следующие типы масс-анализаторов.

1. Непрерывные масс-анализаторы:
- магнитный и электростатический секторный масс-анализатор;
- квадрупольный масс-анализатор.
2. Импульсные масс-анализаторы:
- времяпролегный масс-анализатор;
- ионная ловушка;
- квадрупольная линейная ловушка;
- масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-прсобразованием;
- орбитрэп.

Разница между непрерывными и импульсными масс-анализаторами заключается в том, что в первые ионы поступают непрерывным потоком, а во вторые – порциями, через определенные интервалы времени.

Масс-спектрометр может иметь два масс-анализатора. Такой масс-спектрометр называют тандемным. Тандемные масс-спектрометры применяются, как правило, вместе с "мягкими" методами ионизации, при которых не происходит фрагментации ионов анализируемых молекул (молекулярных ионов). Таким образом первый масс-анализатор анализирует молекулярные ионы. Покидая первый масс-анализатор, молекулярные ионы фрагментируются под действием соударений с молекулами инертного газа или излучения лазера, после чего их фрагменты анализируются во втором масс-анализаторе. Наиболее распространенными конфигурациями тандемных масс-спектрометров являются квадруполь – квадрупольная и квадруполь-времяпролетная.

Последним элементом описываемого нами упрощенного масс-спектрометра является детектор заряженных частиц. Первые масс-спектрометры использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод, выбивает из него пучок электронов, которые, в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него еще большее количество электронов и т.д. Другой вариант – фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора.

Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея).

Масс-спектрометры используются для анализа органических и неорганических соединений. Органические вещества в большинстве случаев представляют собой многокомпонентные смеси индивидуальных компонентов. Например, показано, что запах жареной курицы составляют 400 компонентов (т.е. 400 индивидуальных органических соединений). Задача аналитики состоит в том, чтобы определить, сколько компонентов составляют органическое вещество, узнать, какие это компоненты (идентифицировать их) и сколько каждого соединения содержится в смеси. Для этого идеальным является сочетание хроматографии с масс-спектрометрией. Газовая хроматография как нельзя лучше подходит для сочетания с ионным источником масс-спектрометра с ионизацией электронным ударом или химической ионизацией, поскольку в колонке хроматографа соединения уже находятся в газовой фазе. Приборы, в которых масс-спектрометрический детектор скомбинирован с газовым хроматографом, называются хромато-масс-спектрометрами ("Хромасс").

Многие органические соединения невозможно разделить на компоненты с помощью газовой хроматографии, но можно разделить с помощью жидкостной хроматографии. Для сочетания жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией сегодня используют источники ионизации в электроспрес и химической ионизации при атмосферном давлении, а комбинацию жидкостных хроматографов с масс-спектрометрами называют ЖХ/МС. Самые мощные системы для органического анализа, востребованные современной протеомикой, строятся на основе сверхпроводящего магнита и работают по принципу ионно-циклотронного резонанса.

Наиболее широкое распространение получил в последнее время масс-анализатор, позволяющий наиболее точно померить массу иона, и обладающий очень высоким разрешением. Высокое разрешение позволяет работать с полипротонированными ионами, образующимися при ионизации белков и пептидов в электроспрее, а высокая точность определения массы позволяет получать брутто-формулу ионов, делая возможным определять структуру последовательностей аминокислотных остатков в пептидах и белках, а также детектировать послетрансляционные модификации белков. Это сделало возможным секвенировать белки без их предварительного гидролиза на пептиды. Такой способ получил название "Top-down" протеомики. Получение уникальной информации стало возможно благодаря применению масс-анализатора ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием. В этом анализаторе ионы влетают в сильное магнитное поле и вращаются там по циклическим орбитам (как в циклотроне, ускорителе элементарных частиц). Такой масс-анализатор обладает определенными преимуществами: имеет очень высокое разрешение, диапазон измеряемых масс весьма широк, может анализировать ионы, получаемые всеми способами. Однако для своей работы он требует сильного магнитного ноля, а значит, использования сильного магнита со сверхпроводящим соленоидом, поддерживаемым при очень низкой температуре (жидкого гелия, приблизительно -270°С).

Важнейшая характеристика при анализе органических соединений – это чувствительность. Для того чтобы достигнуть как можно большей чувствительности при улучшении отношения сигнала к шуму, прибегают к детектированию по отдельным выбранным ионам. Выигрыш в чувствительности и селективности при этом колоссальный, но при использовании приборов низкого разрешения приходится приносить в жертву другой важный параметр – достоверность. Использование высокого разрешения на приборах с двойной фокусировкой позволяет добиваться высокого уровня достоверности, не жертвуя при этом чувствительностью.

Для достижения высокой чувствительности можно еще использовать тандемную масс-спектрометрию, когда каждый пик, соответствующий одиночному иону, можно подтвердить масс-спектром дочерних ионов. Абсолютным рекордсменом по чувствительности является органический хромато-масс-спектрометр высокого разрешения с двойной фокусировкой.

По характеристике сочетания чувствительности с достоверностью определения компонентов следом за приборами высокого разрешения идут ионные ловушки. Классические квадрупольные приборы нового поколения имеют улучшенные характеристики благодаря ряду инноваций, примененных в них, например использованию с целью снижения шума искривленного квадрупольного префильтра, предотвращающего попадание нейтральных частиц на детектор.

Введение
Краткая история масс-спектрометрии
Ионизация
Масс-анализаторы
Детектор
Природная и искусственная изотопия
Масс-спектрометры для изотопного анализа
Скорость сканирования
Разрешение
Динамический диапазон
Чувствительность
Какие бывают масс-спектрометры

Итак, масс-спектрометры используются для анализа органических соединений и неорганических.

Многие органические соединения невозможно разделить на компоненты с помощью газовой хроматографии, но можно с помощью жидкостной хроматографии. Для сочетания жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией сегодня используют источники ионизации в электроспрее (ESI) и химической ионизации при атмосферном давлении (APCI), а комбинацию жидкостных хроматографов с масс-спектрометрами называют ЖХ/МС или LC/MS по английски. Cамые мощные системы для органического анализа, востребованные современной протеомикой, строятся на основе сверхпроводящего магнита и работают по принципу ионно-циклотронного резонанса. Они также носят название FT/MS, поскольку в них используется Фурье преобразование сигнала.

Новый класс масс-спектрометров - это гибридные приборы. Гибридными их называют потому, что они, на самом деле, включают в себя два масс-спектрометра, по крайней мере один из которых, может работать как независимый прибор. Примерами таких приборов являются масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса FINNIGAN LTQ FT, в котором линейная квадрупольная ионная ловушка FINNIGAN LTQ может работать как индивидуальный прибор, детектирующий ионы после МС или МСn с помощью двух вторично-электронных умножителей, так и готовить и пересылать ионы в циклотронную ячейку, выталкивая их в направлении, параллельном оси квадруполя. Также гибридным является LTQ QRBITRAP, который работает совершенно аналогично. Преимущества таких схем очевидны, линейная ловушка обладает самой высокой чувствительностью, работает в режиме тандемной масс-спектрометрии с n до 10, осуществляет разнообразные интеллектуальные функции сканирований, а масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса и орбитальная ловушка ионов обладают высоким разрешением и могут с высочайшей точностью измерять отношения массы к заряду ионов. Для анализа элементного состава самыми привлекательными являются масс-спектрометры с индуктивно-связанной плазмой. С помощью этого прибора определяют из каких атомов составлено вещество. Этот же метод анализа может показывать и изотопный состав. Но лучше всего измерять изотопный состав с помощью специализированных изотопных приборов, регистрирующих ионы не на одном детекторе в разное время их прихода на него, а каждый ион на своем персональном коллекторе и одновременно (так называемое параллельное детектирование).

Однако, прежде чем перейти к приборам для измерения изотопного состава, кратко остановимся на том что такое изотопы.

Природная и искусственная изотопия Атомы состоят из ядра и электронных оболочек. Свойства атомов определяются тем, сколько протонов (положительно заряженных элементнарных частиц) содержит ядро. Ядро помимо протонов содержит и нейтроны. Природа распорядилась так, что при равном количестве протонов ядро может содержать разное количество нейтронов. Атомы с одинаковым количеством протонов в ядре, но с разным количеством нейтронов отличаются по массе на одну или несколько единиц атомной массы (а.е.м.) и называются изотопами. Большинство элементов имеют определенный набор стабильных изотопов. Радиоактивные изотопы не являются стабильными и распадаются с образованием стабильных изотопов. Природная распространенность изотопов для каждого элемента известна. Некоторые элементы в природе являются моноизотопными, то есть 100 % природной распространенности приходится на один изотоп (например, Al, Sc, Y, Rh, Nb и т.д.), а другие имеют множество стабильных изотопов (S, Ca, Ge, Ru, Pd, Cd, Sn, Xe, Nd, Sa и т.д.). В технологической деятельности люди научились изменять изотопный состав элементов с целью получения каких-либо специфических свойств материалов (например, U235 имеет способность к спонтанной цепной реакции и может использоваться в качестве топлива для атомных электростанций или атомной бомбы) или использования изотопных меток (например, в медицине).

Поскольку массы изотопов отличаются, а масс-спектрометрия измеряет массу, естественно, этот метод становится самым удобным для определения изотопного состава. В то же время, информация по изотопному составу помогает идентифицировать органические соединения и позволяет дать ответы на многие вопросы начиная от определения возраста пород для геологии и кончая определением фальсификатов многих продуктов и установлением места происхождения товаров и сырья.

Масс-спектрометры для изотопного анализа. Масс-спектрометры для определения изотопного состава должны быть очень точными. Для анализа изотопного состава легких элементов (углерод, водород, кислород. сера, азот и т.д.) используется ионизация электронным ударом. В этом случае годятся все методы ввода газовой фазы, как и в органических масс-спектрометрах (DELTA Plus ADVANTAGE, FINNIGAN DELTA Plus XL и FINNIGAN МАТ253).
Для анализа изотопов более тяжелых элементов используется термоионизация (FINNIGAN TRITON TI) или ионизация в индуктивно-связанной плазме c параллельным детектированием (FINNIGAN NEPTUNE, и одноколлекторным детектированием FINNIGAN ELEMENT2).
Практически во всех типах изотопных масс-спектрометров используются магнитные масс-анализаторы.

Характеристики масс-спектрометров и масс-спектрометрических детекторов

Важнейшими техническими характеристиками масс-спектрометров являются чувствительность, динамический диапазон, разрешение, скорость.

Скорость сканирования. Масс-анализатор, как мы показывали выше, пропускает ионы с определенным соотношением массы и заряда в определенное время (кроме многоколлекторных приборов и ионно-циклотронного резонанса, орбитальной ловушки ионов). Для того, чтобы проанализировать все ионы по отношению их массы к заряду он должен сканировать, то есть параметры его поля должны за заданный промежуток времени пройти все значения, нужные для пропускания к детектору всех интересующих ионов. Эта скорость разворачивания поля называется скоростью сканирования и должна быть как можно больше (соответственно, время сканирования должно быть как можно меньше), поскольку масс-спектрометр должен успеть измерить сигнал за короткое время, например за время выхода хроматографического пика, которое может составлять несколько секунд. При этом, чем больше масс-спектров за время выхода хроматографического пика будет измерено, тем точнее будет описан хроматографический пик, тем менее вероятно будет проскочить мимо его максимального значения, а с помощью математической обработки определить является ли он индивидуальным и «доразделить» его с помощью масс-спектрометрии.
Самым медленным масс-анализатором является магнит, минимальное время его сканирования без особой потери чувствительности составляет доли секунды (MAT 95XP). Квадрупольный масс-анализатор может разворачивать спектр за десятые доли секунды (TSQ QUANTUM), а ионная ловушка еще быстрее (POLARISQ, FINNIGAN LCQ ADVANTAGE MAX, FINNIGAN LCQ DECA XP MAX), линейная ионная ловушка - еще быстрее (LTQ) и чуть медленнее масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса FINNIGAN LTQ FT.
Инновационный квадрупольный хромато-масс-спектрометр FINNIGAN TRACE DSQ и его экономичный аналог FINNIGAN FOCUS DSQ способны сканировать со скоростью около 11,000 а.е.м. в секунду. Это открывает новые возможности, например, можно практически одновременно получать полный масс-спектр соединения для его однозначной идентификации и вести селективный мониторинг ионов (SIM), на несколько порядков понижающий предел обнаружения.
Любое сканирование всех перечисленных выше масс-анализаторов является компромиссным - чем больше скорость сканирования, тем меньше времени тратиться на запись сигнала на каждое массовое число, тем хуже чувствительность. Однако, для обычного анализа скорости квадрупольного анализатора или ионной ловушки достаточно. Другой вопрос, когда речь идет о высокопроизводительном анализе сложных матриц. В этом случае было бы хорошо воспользоваться сверхбыстрой хроматографией (на тонких коротких быстро прогреваемых колонках). Для такой задачи лучше всего подойдет времяпролетный масс-спектрометр (TEMPUS). Он способен записывать масс-спектры со скоростью 40,000 в секунду!

Разрешение. Наглядно разрешение (разрешающую способность) можно определить, как возможность анализатора разделять ионы с соседними массами. Очень важно иметь возможность точно определять массу ионов, это позволяет вычислить атомную композицию иона или идентифицировать пептид путем сравнения с базой данных, сократив число кандидатов с тысяч и сотен до единиц или одного единственного. Для магнитных масс-анализаторов, для которых расстояние между пиками масс-спектра не зависит от масс ионов, разрешение представляет собой величину равную M/DM. Эта величина, как правило, определяется по 10 % высоте пика. Так например, разрешение 1000 означает, что пики с массами 100.0 а.е.м. и 100.1 а.е.м. отделяются друг от друга, то есть не накладываются вплоть до 10 % высоты.
Для анализаторов, у которых расстояние между пиками меняется в рабочем диапазоне масс (чем больше масса, тем меньше расстояние), таких как квадрупольные анализаторы, ионные ловушки, времяпролетные анализаторы, строго говоря, разрешение имеет другой смысл. Разрешение, определяемое как M/DM в данном случае, характеризует конкретную массу. Имеет смысл характеризовать эти масс-анализаторы по ширине пиков, величине, остающейся постоянной во всем диапазоне масс. Эта ширина пиков, обычно, измеряется на 50 % их высоты. Для таких приборов ширина пика на полувысоте равная 1 является неплохим показателем и означает, что такой масс-анализатор способен различить номинальные массы, отличающиеся на атомную единицу массы практически во всем его рабочем диапазоне. Номинальной массой или массовым числом называют ближайшее к точной массе иона целое число в шкале атомных единиц массы. Например, масса иона водорода Н+ равна 1.00787 а.е.м., а его массовое число равно 1. А такие масс-анализаторы, которые, в основном, измеряют номинальные массы, называют анализаторами низкого разрешения. Мы написали «в основном», потому что сегодня есть и такие масс-анализаторы, которые формально относятся к низкоразрешающим, а на деле таковыми уже не являются. Высокая технология, прежде всего самого передового разработчика Thermo Electron, уже сегодня предложила на рынок аналитического оборудования высокоразрешающие квадрупольные приборы. Так например, новейший FINNIGAN TSQQuantum легко работает при ширине пика масс-спектра на полувысоте 0.1 а.е.м. Знающие люди могут возразить: «Но такую ширину пика можно получить на каждом квадрупольном масс-спектрометре!» И они будут правы, действительно, каждый квадруполь можно отстроить до этого уровня разрешения. Но что произойдет при этом с сигналом? При переходе от ширины пика на полувысоте в 1 а.е.м. к 0.1 а.е.м. величина сигнала на всех квадруполях упадет практически на два порядка по величине. Но не на TSQ Quantum , на нем она уменьшится всего в два с половиной раза. Ионные ловушки в узком диапазоне масс могут работать как масс-спектрометры высокого разрешения, обеспечивая, как минимум, разделение пиков, отстоящих на 1/4 а.е.м. друг от друга. Масс-спектрометры с двойной фокусировкой (магнитной и электростатической), ионно-циклотронного резонанса - приборы среднего или высокого разрешения. Типичным для магнитного прибора разрешением является >60,000, а работа на уровне разрешения 10,000 - 20,000 является рутинной. На масс-спектрометре ионно-циклотронного резонанса на массе около 500 а.е.м. можно легко достигнуть разрешения 500,000, что позволяет проводить измерения массы ионов с точностью до 4-5 знака после запятой. Разрешения в несколько тысяч также можно добиваться при использовании времяпролетных масс-анализаторов, однако, на высоких массах, в области которых, собственно этот прибор имеет преимущество перед другими, и этого разрешения хватает лишь для того, чтобы измерить массу иона с точностью +/- десятки а.е.м.Как видно из вышесказанного, разрешение тесно связано с другой важной характеристикой - точностью измерения массы. Проиллюстрировать значение этой характеристики можно на простом примере. Массы молекулярных ионов азота (N2+)и монооксида углерода (СО+) составляют 28.00615 а.е.м. и 27.99491 а.е.м., соответственно (оба характеризуются одним массовым числом 28). Эти ионы будут регистрироваться масс-спектрометром порознь при разрешении 2500, а точное значение массы даст ответ - какой из газов регистрируется. Измерение точной массы доступно на приборах с двойной фокусировкой, на тандемном квадрупольном масс-спектрометре TSQ Quantum и на масс-спектрометрах ионно-циклотронного резонанса.

Динамический диапазон. Если мы анализируем смесь, содержащую 99.99 % одного соединения или какого-либо элемента и 0.01% какой-либо примеси, мы должны быть уверены, что правильно определяем и то и другое. Для того, чтобы быть уверенным в определении компонентов в этом примере, нужно иметь диапазон линейности в 4 порядка. Современные масс-спектрометры для органического анализа характеризуются динамическим диапазоном в 5-6 порядков, а масс-спектрометры для элементного анализа 9-12 порядков. Динамический диапазон в 10 порядков означает, что примесь в пробе будет видна даже тогда, когда она составляет 10 миллиграмм на 10 тонн.

Чувствительность. Это одна из важнейших характеристик масс-спектрометров. Чувствительность это величина, показывающая какое количество вещества нужно ввести в масс-спектрометр для того, чтобы его можно было детектировать. Для простоты будем рассматривать связанный с чувствительностью параметр - минимальное определяемое количество вещества, или порог обнаружения. Типичная величина порога обнаружения хорошего хромато-масс-спектрометра, используемого для анализа органических соединений, составляет 1 пикограмм при вводе 1 микролитра жидкости. Давайте представим себе что это такое. Если мы наберем специальным шприцом 1 микролитр жидкости (одна миллионная доля литра) и выпустим ее на листок чистой белой бумаги, то при ее рассмотрении в лупу мы увидим пятнышко, равное по размерам следу от укола тонкой иглой. Теперь представим себе, что мы бросили 1 грамм вещества (например, одну таблетку аспирина) в 1000 тонн воды (например, бассейн длиной 50 метров, шириной 10 метров и глубиной 2 метра). Тщательно перемешаем воду в бассейне, наберем шприцом 1 микролитр этой воды и заколем в хромато-масс-спектрометр. В результате анализа мы получим масс-спектр, который мы сможем сравнить с библиотечным спектром и методом отпечатков пальцев убедиться в том, что это действительно ацетилсалициловая кислота, иначе называемая аспирином.

Пределы обнаружения неорганических веществ, например, методом ICP/MS (FINNIGAN ELEMENT2) еще более впечатляющие. Здесь бассейн уже будет маловат для приготовления раствора с концентрацией, соответствующей пределу обнаружения. Предел обнаружения для FINNIGAN ELEMENT2 по ряду металлов составляет 1 ppq (одна доля на квадриллион). Это значит, что чувствительности прибора достаточна, чтобы детектировать 1 килограмм металла (например, ртути, свинца и т.д.) растворенного в озере Байкал (при условии его перемешивания и полного растворения)!

В масс-спектрометрии изотопов, например, достаточно 800 - 1000 молекул диоксида углерода (СО2, углекислый газ) чтобы получить сигнал углерода. Для того, чтобы продемонстрировать, с какими точностями и изотопными чувствительностями имеет дело изотопная масс-спектрометрия, прибегнем к следующей аллегории. Предположим на одну тысячу совершенно одинаковых яблок, каждое из которых весит 100 грамм, приходится 11 яблок, весящих на 8 % больше, то есть 108 грамм. Все эти яблоки собраны в одном мешке. Этот пример соотвествует соотношению изотопов углерода в природе - на 1000 атомов 12С приходится 11 атомов 13С. Изотопная масс-спектрометрия измеряет соотношения, то есть она способна различить не просто эти 11 яблок, а найти среди многих мешков те, в которых из 1000 стограммовых яблок не 11 стовосьми граммовых, а 10 или 12. Этот пример очень легок для изотопной масс-спектрометрии, на самом деле такие приборы как FINNIGAN DELTAPlus ADVANTAGE, DELTA Plus XP и FINNIGAN МАТ253способны определить разницу в один изотоп (одно сто восьмиграммовое яблоко) среди десяти миллионов атомов (десяти миллионов яблок).

Важнейшая характеристика при анализе органических соединений - это чувствительность. Для того, чтобы достигнуть как можно большей чувствительности при улучшении отношения сигнала к шуму прибегают к детектированию по отдельным выбранным ионам. Выигрыш в чувствительности и селективности при этом колоссальный, но при использовании приборов низкого разрешения приходится приносить в жертву другой важный параметр - достоверность. Ведь если Вы записывали только один пик из всего характеристического масс-спектра, Вам понадобится еще много поработать, чтобы доказать, что этот пик соответствует именно тому компоненту, который Вас интересует. Как же разрешить эту проблему? Использовать высокое разрешение на приборах с двойной фокусировкой, где можно добиться высокого уровня достоверности не жертвуя чувствительностью. Или использовать тандемную масс-спектрометрию, когда каждый пик, соответствующий одиночному иону можно подтвердить масс-спектром дочерних ионов. Итак, абсолютным рекордсменом по чувствительности является органический хромато-масс-спектрометр высокого разрешения с двойной фокусировкой. Так, например, паспортная характеристика DFS гласит, что 2,3,7,8-тетрахлоро-п-дибензодиоксин, введенный через хроматографическую колонку в количестве 10 фемтограмм даст пик, характеризующийся отношением сигнал/шум = 80: 1. Не достижимый ни на каком другом приборе результат!
По характеристике сочетания чувствительности с достоверностью определения компонентов следом за приборами высокого разрешения идут ионные ловушки. Классические квадрупольные приборы нового поколения (TRACE DSQ II) имеют улучшенные характеристики благодаря ряду инноваций, примененных в них, например, использованию искривленного квадрупольного префильтра, предотвращающего попадание нейтральных частиц на детектор и, следовательно, снижению шума.

Зачем нужна масс-спектрометрия

Глубинные физические законы, передовые научные и инженерные разработки, высокотехнологичные вакуумные системы, высокие электрические напряжения, самые лучшие материалы, высочайшее качество их обработки, современнейшая быстродействующая цифровая и аналоговая электроника и компьютерная техника, изощренное программное обеспечение - вот из чего сложен современный масс-спектрометр. И для чего же все это? Для ответа на один из важнейших вопросов мироздания - из чего сложена материя. Но это вопрос не высокой науки, а каждодневной жизни человека.

Например, разработка новых лекарственных средств для спасения человека от ранее неизлечимых болезней и контроль производства лекарств, генная инженерия и биохимия, протеомика. Масс-спектрометрия дала в руки исследователей инструмент, позволяющий идентифицировать белки, определять какие изменения произошли с их структурой вследствие различных взаимодействий, при их воспроизводстве, определить пути метаболизма различных лекарственных средств и других соединений и идентифицировать метаболиты, разрабатывать новые целевые лекарственные средства. Масс-спектрометрия - единственный метод, решающий все эти и многие другие задачи аналитической биохимии.
Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ.

Выяснение источника происхождения очень важно для решения целого ряда вопросов: например, определение происхождения взрывчатых веществ помогает найти террористов, наркотиков - бороться с их распространением и перекрывать пути их трафика. Экономическая безопасность страны более надежна, если таможенные службы могут не только подтверждать анализами в сомнительных случаях страну происхождения товара, но и его соотвествие заявленному виду и качеству. А анализ нефти и нефтепродуктов нужен не только для оптимизации процессов переработки нефти или геологам для поиска новых нефтяных полей, но и для того, чтобы определить виновных в разливах нефтяных пятен в океане или на земле.

Существование ядерной энергетики немыслимо без масс-спектрометрии. С ее помощью определяется степень обогащения расщепляющихся материалов и их чистота.

Конечно и медицина не обходится без масс-спектрометрии. Изотопная масс-спектрометрия углеродных атомов применяется для прямой медицинской диагностики инфицированности человека Helicobacter Pylori и является самым надежным из всех методов диагностики.
ВЭЖХ/МС системы являются основным аналитическим инструментом при разработке новых лекарственных средств. Без этого метода не может обходиться и контроль качества производимых лекарств и выявления такого распространенного явления как их фальсификация.
Протеомика дала в руки медицины возможность сверхранней диагностики самых страшных заболеваний человечества - раковых опухолей и кардиологических дисфункций. Определение специфических белков, называемых биомаркерами, позволяет проводить раннюю диагностику в онкологии и кардиологии.

Трудно представить область человеческой деятельности, где не нашлось бы места масс-спектрометрии. Ограничимся просто перечислением: биохимия, клиническая химия, общая химия и органическая химия, фармацевтика, косметика, парфюмерия, пищевая промышленность, химический синтез, нефтехимия и нефтепереработка, контроль окружающей среды, производство полимеров и пластиков, медицина и токсикология, криминалистика, допинговый контроль, контроль наркотических средств, контроль алкогольных напитков, геохимия, геология, гидрология, петрография, минералогия, геохронология, археология, ядерная промышленность и энергетика, полупроводниковая промышленность, металлургия.