Непрямые серологические реакции. реакции непрямой гемагглютинации (рнга), связывания комплемента (рск). Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (рнга, рпга) Реакция обратной пассивной гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. 34. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Рис. 34. Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). А - получение эритроцитарного диагностикума: Б - РПГА: 1 - эритроцит: 2 - изучаемый антиген; 3 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело к изучаемому антигену: 5 - агглютинат

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56° С, разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РИГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.

Контрольные вопросы

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли агглютинация эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

Задание

Учтите и зарегистрируйте результат РИГА.

Реакция преципитации

В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.

Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации

Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Контрольные вопросы

1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?

2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?

Задание

1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.

2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Реакция лизиса (иммунный цитолиз)

Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).

4. Изотонический раствор.

Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:

1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.

2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.

Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.

* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )

3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).

4. Изотонический раствор.

Таблица 19. Схема реакции гемолиза

Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,

В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).

Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:

Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.

Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)

В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.

При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.

Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.

Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.

Контрольные вопросы

1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?

2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?

Задание

Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.

Похожая информация.

Занятие 14

Тема: Непрямые серологические реакции. Реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), связывания комплемента (РСК).

Антитела

Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенами . Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины. У млекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Строение иммуноглобулинов . Наиболее “типичное” строение имеют IgG. Молекула состоит из 4 белковых цепей: двух легких (L) и двух тяжелых (H), которые соединены между собой дисульфидными связями. Участок антитела, который связывается с антигеном, называется активным центром антитела. В молекуле IgG имеется 2 активных центра. Он образован N-концевыми участками тяжелой и легкой цепей. Участок тяжелых цепей, расположенный вблизи дисульфидных связей, называется шарнирной областью. С помощью фермента папаина молекула IgG выше шарнирной области расщепляется на 3 фрагмента: 2 из них содержат легкую цепь и часть тяжелой цепи (Fab-фрагменты); а третий фрагмент состоит только из части тяжелых цепей (Fc-фрагмент). Благодаря подвижной шарнирной области Fab-фрагменты могут изменять взаимное расположение в пространстве.

Аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей делятся на константные (постоянные) и вариабельные участки. Вариабельные участки находятся на N-концах легких и тяжелых цепей (VL и VH). Константные участки находятся на С-концах цепей (СL и СH). В легких и тяжелых цепях аминокислотные последовательности образуют несколько глобулярных структур, которые называются доменами.

Активный центр антитела образуется вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей и представляет собой полость (паратоп ), имеющую определенную конфигурацию и распределение электрических зарядов на своей поверхности. Размер, форма и распределение зарядов в активном центре определяет его специфичность, то есть способность связываться с определенной антигенной детерминантой (эпитопом ), имеющей комплементарную структуру.

Антигенные детерминанты представляют собой участки, выступающие на поверхности молекул антигенов. Поэтому взаимодействие эпитоп-паратоп происходит по принципу “ключ-замок”.

Прочность связи активного центра антител с антигенной детерминантой характеризуется понятием аффинность. Аффинность – это мера сродства активного центра и антигенной детерминанты.

На долю иммуноглобулинов класса IgG приходится 75% от общего количества сывороточных имуноглобулинов. Важным свойством IgG является их способность проходить через плаценту. Таким образом, материнские антитела попадают в организм ребенка и защищают его в первые месяцы жизни от инфекции (естественный пассивный иммунитет).

К классу IgM относится около 10% общего пула иммуноглобулинов. Молекула IgM представляет собой пентамер, то есть состоит из 5 одинаковых молекул, сходных по своему строению с молекулой IgG, имеет 10 активных центров. Субъединицы соединены между собой дисульфидными связями. В молекуле IgM имеется дополнительная J-цепь, которая связывает субъединицы. Антитела класса IgM не проходят через плацентарный барьер.

Антитела класса IgА составляют 15-20% от общего содержания иммуноглобулинов. Молекула IgА состоит из 2-х легких и 2-х тяжелых цепей, имеет 2 активных центра. В сыворотке крови IgА присутствуют в мономерной форме, тогда как в секретах слизистых оболочек IgА представлены в виде димеров и называются секреторными или sIgА, имеют 4 активных центра. С-концы тяжелых цепей в молекуле sIgА соединены между собой J-цепью и белковой молекулой, которая называется секреторный компонент. Секреторный компонент защищает sIgА от расщепления протеолитическими ферментами, которые содержатся в большом количестве в секрете слизистых оболочек. Основная функция sIgА – защита слизистых оболочек от инфекции. IgА не проникают через плацентарный барьер. Высокая концентрация sIgА обнаруживается в женском грудном молоке, особенно в первые дни лактации. Они защищают желудочно-кишечный тракт новорожденного от инфекции.

IgD в основном находятся на мембране В-лимфоцитов. Имеют строение, подобное IgG, 2 активных центра. Биологическая роль до конца не известна.

IgЕ – концентрация этого класса иммуноглобулинов в сыворотке крови чрезвычайно низкая. Молекулы IgЕ в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов. По своему строению IgЕ сходен с IgG, имеет 2 активных центра. Предполагается, что IgЕ имеет существенное значение в развитии антигельминтозного иммунитета. IgЕ играет главную роль в патогенезе некоторых аллергических заболеваний (бронхиальная астма , сенная лихорадка) и анафилактического шока.

Реакция непрямой гемагглютинации

В непрямых серологических реакциях комплекс антигенов с антителами не виден невооруженным глазом. В таких случаях антигены адсорбируют на более крупных частицах-носителях (эритроцитах, частицах латекса), получая антигенный эритроцитарный диагностикум. Последующая агглютинация специфическими антителами таких частиц позволяет видеть агглютинат (осадок) невооруженным глазом. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) выявляет антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Эритроциты с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

РНГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями сыворотки крови, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Такую реакцию называют РОНГА – реакцией обратной непрямой гемагглютинации.

Компоненты РНГА:

Сыворотка крови больного (разведение 1:25);

Эритроцитарный диагностикум (эритроциты, нагруженные антигеном исследуемого возбудителя);

Промывной раствор.

Постановка РНГА. В семь лунок планшета для иммунологических исследований вносят по две капли фосфатного буферного раствора. В первую лунку прибавляют две капли сыворотки крови больного, после чего из первой лунки переносят 2 капли во вторую лунку, из второй – в третью и т. д. Из шестой лунки 2 капли удаляют. Во все семь лунок (6 опытных и 1 контрольную) прибавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Планшеты оставляют при комнатной температуре на 45 минут, после чего учитывают результаты.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соединении антигена с антителом образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. Если комплекс антигена с антителом не образуется, то комплемент остается свободным. Свободный комплемент выявляется добавлением к смеси гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и антител против них. Положительная реакция – отсутствие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом антиген+антитело. Отрицательная реакция – наличие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом эритроцит+антиэритроцитарное антитело.

Компоненты РСК:

Сыворотка крови здорового;

Сыворотка крови больного (в разведении 1:5);

Антигенный компонент реакции - инактивированный возбудитель;

Комплемент в разведении, соответствующем рабочей дозе. Комплемент получают из сыворотки крови морской свинки. Титром комплемента является его минимальная доза, которая в присутствии гемолитической сыворотки вызывает полный гемолиз эритроцитов. Рабочая доза комплемента, используемая при постановке РСК, на 30% больше его титра;

Гемолитическая система - взвесь эритроцитов барана, обработанных кроличьими антителами к эритроцитам барана.

Промывочный раствор.

Постановка РСК. РСК ставят в двух пробирках – опытной и контрольной. В опытную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови больного, в контрольную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови здорового донора, в обе пробирки вносят по 0,5 мл лизата возбудителя, а также по 0,5 мл комплемента. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. После инкубации в обе пробирки вносят по 1,0 мл гемолитической системы. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. При положительной реакции в опытной пробирке отмечается задержка гемолиза (жидкость бесцветная и осадок эритроцитов), в контрольной пробирке – гемолиз эритроцитов.

Литература для подготовки к занятию:

1. Борисов микробиология, вирусология , иммунология. М., 2002.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. . М., 2004.

3. Поздеев микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

11621 0

Серологические реакции обозначают в соответствии с феноменами, сопровождающими образование комплекса антиген — антитело при взаимодействии различных по свойствам компонентов. Различают реакции агглютинации, преципитации и лизиса.

Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации (РА) основана на применении корпускулярного антигена (взвесь бактерий, сенсибилизированных эритроцитов, частиц латекса и др.), взаимодействующего со специфическими антителами, в результате чего образующийся комплекс антиген - антитело выпадает в виде осадка. Эту реакцию широко применяют в лабораторной практике для серологической диагностики бактериальных инфекций и для идентификации выделенных микроорганизмов.

РА используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза (реакции Райта, Хеддльсона), туляремии, лептоспироза (РАЛ - реакция агглютинации и лизиса лептоспир), листериоза, сыпного тифа (РАР - реакция агглютинации риккетсий), шигеллеза, иерсиниоза, псевдотуберкулеза и др.

Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РИГА или РПГА).

Для постановки этой реакции используют эритроциты животных (барана, обезьяны, морских свинок, некоторых птиц), сенсибилизированных антителами или антигеном, что достигается инкубацией взвеси эритроцитов и раствора антигена или иммунной сыворотки.

Диагностикумы, полученные на основе эритроцитов, сенсибилизированных антигенами, называют антигенными эритроцитарными диагностикумами . Они предназначены для определения антител в серийных разведениях сывороток крови, например эритроцитарные шигеллезные диагностикумы, эритроцитарные сальмонеллезные О-диагностикумы.

Соответственно диагностикумы на основе эритроцитов, сенсибилизированных специфическими иммуноглобулинами, называют антительными (иммуноглобулиновыми) диагностикумами и они служат для выявления антигенов в различном материале, например эритроцитарный иммуноглобулиновый дифтерийный диагностикум для РИГА, применяемый для выявления дифтерийного экзотоксина коринебактерий в жидкой питательной среде при посеве в нее материала из носа и ротоглотки.

Реакцию гемагглютинации применяют для диагностики как бактериальных (брюшной тиф, паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), так и вирусных (грипп, аденовирусные инфекции, корь и др.) инфекций. По чувствительности и специфичности РИГА превосходит РА.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют для титрования противовирусных антител в сыворотках крови, а также с целью установления типовой принадлежности выделенных вирусных культур. РТГА можно применить для диагностики тех вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами.

Принцип метода состоит в том, что сыворотка, содержащая антитела к конкретному типу вируса, подавляет его гемагглютинирующую активность и эритроциты остаются неагглютинированными.

Реакция торможения (задержки) пассивной гемагглютинации (РТПГА).

В РТПГА участвуют три компонента: иммунная сыворотка, антиген (исследуемый материал) и сенсибилизированные эритроциты.

Если в исследуемом материале есть антиген, специфически реагирующий с антителами иммунной стандартной сыворотки, то он связывает их, и при последующем добавлении эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, гомологичным сыворотке, гемагглютинация не наступает.

РТПГА применяют для обнаружения микробных антигенов, для количественного их определения, а также для контроля специфичности РПГА.

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

В качестве носителя антител (иммуноглобулинов) используют частицы латекса. РЛА является экспресс-методом диагностики инфекционных болезней, учитывая время проведения (до 10 мин) и возможность обнаружить антиген в небольшом объеме исследуемого материала.

РЛА применяют для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типа b, Neisseria meningitidis в цереброспинальной жидкости, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, для диагностики сальмонеллеза, иерсиниозов и других заболеваний. Чувствительность метода составляет 1-10 нг/мл, или 10³ -10⁶ бактериальных клеток в 1 мкл.

Реакция коагглютинации (РКоА)

Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А стафилококков присоединять специфические иммуноглобулины. РКА - метод экспресс-диагностики - служит для выявления растворимых термостабильных антигенов в секретах человека и в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Обнаружение специфических антигенов в составе ЦИК требует их предварительного осаждения из сыворотки крови.

Реакция преципитации

В реакции преципитации (РП) в результате взаимодействия антител с высокодисперсными растворимыми антигенами (белки, полисахариды) образуются комплексы с участием комплемента - преципитаты. Это чувствительный тест, используемый для выявления и характеристики разнообразных антигенов и антител. Простейшим примером качественной РП является образование непрозрачной полосы преципитации в пробирке на границе наслоения антигена на иммунную сыворотку - реакция кольцепреципитации. Широко применяют различные разновидности РП в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез).

Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция связывания комплемента (РСК) основана на феномене гемолиза с участием комплемента, т.е. способна выявлять только комплементсвязывающие антитела.

РСК широко применяют для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций, риккетсиозов, хламидиозов, инфекционного мононуклеоза, протозойных инфекций, гельминтозов. РСК является сложной серологической реакцией, в которой участвуют две системы: исследуемая (сыворотка крови), представленная системой антиген - антитело и комплементом, и гемолитическая (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). Гемолитическая сыворотка представляет собой инактивированную прогреванием сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Она содержит антитела против эритроцитов барана.

Положительный результат РСК - отсутствие гемолиза - наблюдают в случае, если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену. При этом образовавшийся комплекс антиген - антитело связывает комплемент, а в отсутствии свободного комплемента добавление гемолитической системы не сопровождается гемолизом. В случае отсутствия в сыворотке антител, соответствующих антигену, образования комплекса антиген - антитело не происходит, комплемент остается свободным и сыворотка вызывает гемолиз эритроцитов, т.е. наличие гемолиза - это отрицательный результат реакции.

Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Использование сорбированных диагностических препаратов основано на постоянно реализуемом в природе принципе иммунологического распознавания поверхностных структур. С этой точки зрения нет принципиальных различий между использованием, например, микробной клетки или искусственного носителя, нагруженных антигеном (антителами). В качестве основы сорбированных препаратов применяются различные носители - микробные клетки, эритроциты, латекс, бентонин, холестерин, сефадекс, дерматол, активированный уголь, споры грибов и т.д.

После работ А.Т.Кравченко (1945) наибольшее распространение в качестве носителя антигена или антител получили лишенные жизнеспособности и фиксированные различными химическими реагентами эритроциты. На принципе использования в качестве носителя антигена эритроцитов (как нативных, так и фиксированных) широкое распространение получила реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Предложение об использовании реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в диагностических целях возникли на базе предварительно развитых знаний о высокой сорбиционной активности эритроцитов. По сравнению со многими другими носителями антигенов и антител в реакции непрямой гемагглютинации эритроциты имеют определенные преимущества. Во-первых, в изотонических солевых растворах они образуют довольно стойкое сцепление и не оседают за короткое время. Во-вторых, эритроциты одного и того же вида животных одинаковы по размеру. И, наконец, эритроциты сравнительно легко непосредственно или в результате специальной обработки присоединяют различные серологически активные компоненты.

Создание эритроцитарных диагностикумов из стабилизированных эритроцитов позволяет преодолеть те трудности, которые возникают при использовании нативных эритроцитов.

При исследовании эритроцитов, обработанных различными фиксирующими веществами, установлены некоторые их общие свойства:

По морфологии они практически не отличаются от свежих;

Не гемолизируются в гипотонических растворах, в воде и после замораживания-оттаивания;

Могут быть лиофильно высушены;

Их поверхностные структуры сохраняют способность химически модифицироваться (например, танином, диазосоединениями) и вступать в реакцию с антигенами и антителами.

Главный критерий качества фиксированных эритроцитов - возможность их использования для получения сенсибилизированных препаратов при отсутствии неспецифического склеивания в стабилизирующих жидкостях.

Подготовка поверхности эритроцитов с целью повышения сорбиционной способности к антигенам имеет важное значение при конструировании диагностических препаратов. Особенно широкое распространение получила обработка эритроцитов танином.

Под его влиянием изменяются антигенные свойства эритроцитов (проницаемость, скорость оседания), повышается их устойчивость к гемолитическому воздействию некоторых жирных кислот. Достигается, однако, главное - танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбиционной емкостью белков, что широко используется в настоящее время при изготовлении высококачественных антигенных и антительных диагностикумов.

Наряду с танизацией эритроцитов, для изготовления эритроцитарных диагностикумов и подготовки носителя антигена применяются такие химические реагенты, как бромелин, триопсин, перйодат калия, которые также модифицируют мембраны эритроцитов.

После подготовки поверхности эритроцитов идет наиболее важный процесс - процесс гемосенсибилизации - окончательный этап изготовления эритроцитарных диагностикумов.

Для упрочения связи между носителем и антигеном применяются различные конъюгирующие вещества - бисдиазобензидин, дифлуородинитробензин, хлористый циан, хлористый и уксуснокислый кадмий, хлорид брома, формальдегид, глютаровый альдегид, бромциан, риванол, амидол и др.

Использование конъюгирующих веществ способствует устранению тех недостатков, которые имеют танизированные эритроциты, применяемые для сенсибилизации без конъюгирующих веществ.

Наиболее широкое применение нашли такие конъюгирующие вещества, как хлорид хрома, глутаровый альдегид, диазоль черный С, амидол. Процесс сенсибилизации с помощью хлорида хрома происходит очень быстро - от 4 до 10 мин., чем привлекает внимание исследователей. При этом используются концентрации хлорида хрома от 0,05 до 2%, pH - не ниже 5,0 при температуре реакционной смеси 20- 250 С. В процессе сенсибилизации хлоридом хрома активизируются карбоксильные группы белков мембраны эритроцитов. В результате этого образуется ковалентная связь между мембраной эритроцитов и сенситином.

Реакция непрямой гемагглютинации обладает высокой специфичностью, поскольку склеивание эритроцитов наступает в результате взаимодействия антигена с антителами, адсорбированными на эритроцитах. Отличительной ее особенностью является высокая чувствительность: в ней выявляется 0,02-0,05 мкг белка антител. По чувствительности она значительно превосходит реакции иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, радиальной иммунодиффузии, связывания комплемента, нейтрализации. РНГА менее чувствительна, чем методы радиоиммуноэлектрофореза, определения количества белка радиоактивных антител в иммуносорбенте, иммуноферментного анализа.

К достоинствам РНГА следует отнести достаточно высокую воспроизводимость, простоту выполнения, потребность в минимальных количествах ингредиентов, особенно при использовании микрометода.

РНГА в последние годы нашла широкое применение при диагностике инфекционного ринотрахеита, диареи, аденовирусной инфекции, рота- и коронавирусной инфекции, парагриппа - 3 и респираторно – синцитиальной инфекции.

Приводим пример изготовления и применения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к рота- и коронавирусной инфекции.

Методика приготовления антительных диагностикумов для выявления рота- и коронавирусных антигенов в РНГА состоит в следующем: получение суспензии эритроцитов; фиксация их акролеинов; танизация, позволяющая получить стабильную сорбцию необходимого белка на эритроцитах; сенсибилизация танизированных эритроцитов иммуноглобулинами; определение специфичности приготовленного диагностикума. Приготовление суспензии эритроцитов осуществляется путем отбора крови клинически здорового барана в колбу со стеклянными бусами. После дефибринирования крови эритроциты должны быть отмыты 3-5 раз изотоническим (0,9%-ным) раствором натрия хлорида путем центрифугирования в течение 15-20 мин при 400g.

В целях стабилизации эритроцитов проводится их обработка акролеином. Как известно, его действие несколько мягче, чем формальдегида, и обеспечивает стабильность и более высокую активность эритроцитов. Для этого равные объемы 10%-ной взвеси эритроцитов смешивают с 0,2%-ным раствором акролеина, приготовленного на фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7,2. Полученную суспензию выдерживают в течение 30 мин при 37°С, тщательно перемешивая, с последующим освобождением от акролеина многократным центрифугированием в течение 5 мин при 600-800g до полного исчезновения специфического запаха. Преимущество приготовленных таким образом эритроцитов заключается в том, что они заготавливаются впрок, могут длительное время сохраняться, не подвергаясь гемолизу.

В дальнейшем стабилизированные эритроциты в 10%-ной концентрации выдерживают при 2-4 °С в ФБР с рН 7,2 в течение двух месяцев.

Для повышения сорбционной способности и осаждаемости эритроцитов необходимо провести их танизацию путем смешивания равных частей 10%-ной суспензии отмытых эритроцитов и раствора танина на ФБР и рН 7,2 в разведении 1:30000. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 370 С в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от танина дважды в ФБР с рН 7,2 и трижды изотоническим раствором натрия хлорида с рН 7,2-7,4.

Оптимальным сроком гарантирующим получение качественных эритроцитарных диагностикумов является их сенсибилизация в течение 24- 48 часов после их обработки танином.

В процессе изготовления диагностикумов в качестве растворителя и консерванта используют 0,3%-ный фенолизированный изотонический раствор натрия хлорида с 0,1%-ной нормальной кроличьей или лошадиной сывороткой, предварительно инактивированной при 56°С в течение 30 мин и адсорбированной нормальными эритроцитами барана при 37°С в течение 30 мин.

Сенсибилизацию танизированных эритроцитов следует осуществлять гипериммунной сывороткой соответственно против рота- и коронавирусов крупного рогатого скота (производимой во Всероссийском НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко). При этом сенсибилизирующая доза (концентрация белка) антиротавирусной иммунной сыворотки составляет 280 мкг/мл, а иммунной сыворотки к коронавирусу -260 мкг/мл.

Сенсибилизацию проводят, смешивая равные объемы танизированных эритроцитов и предварительно прогретой в течение 30 мин при 560С иммунной сыворотки в оптимальной концентрации. Кроме того, вносят 3 части изотонического раствора натрия хлорида с рН 7,2 и 5 частей 0,1%-ного раствора хлорида хрома. Смесь, периодически помешивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. По истечении указанного времени смесь тщательно отмывают с использованием ФБР с рН 7,2, а затем приготовленные эритроцитарные диагностикумы ресуспендируют в консерванте до 1%-ной концентрации. Приготовленный диагностикум сохраняет свои основные качества в течение 8 мес., при условии хранения его при 4°С.

На всех этапах изготовления диагностикумов осуществляют контроль на самоагглютинацию. Специфичность приготовленных диагностикумов определяют путем постановки РНГА, где в качестве антигенов использовали стандартные диагностикумы вирусов ИРТ, ПГ - 3, аденовирусов, вирусной диареи, а также антигенов рота- и коронавирусов.

При постановке РНГА готовят последовательные двойные разведения исследуемого вируссодержащего материала (20-50%-ная суспензия проб фекалий), а затем в каждую лунку вносят равный объем эритроцитарного диагностикума. Плашки следует тщательно встряхнуть несколько раз, оставить при комнатной температуре до полного оседания эритроцитов в контроле. Показатель положительной реакции - агглютинация эритроцитарного диагностикума с интенсивностью агглютинации на 2+ в титре 1:4 и выше.

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).