Бактериофаги и их практическое применение бактериофа ги

Отличительные свойства бактериофагов как представителей царства Vira. Вирулентные фаги, стадии взаимодействия с бактериальной клеткой. Практическое применение бактериофагов

Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию , при которой происходит репродукция фагов и лизис бактериальной клетки.

Механизм взаимодействия вирулентного фага с микробной клеткой:

1. Адсорбция фага на чувствительной клетке. Происходит при наличии комплементраных рецепторов в клеточной стенке бактерий и на концах нитей фагового отростка. Сперва фаг присоединяется нитями, а затем прочно прикрепляется к клеточной стенке с помощью зубцов банальной пластинки.

2. Проникновение ДНК фага в бактериальную клетку . С помощью лизоцима, находящегося в банальной пластинке, участок клеточной стенки гидролизируется, чехол отростка сокращается и внутренний стержень прокалывать оболочки клетки. Молекула фаговой ДНК по каналу стержня проникает внутрь клетки.

3. Внутриклеточное развитие фага . Фазовая ДНК вносит в бактериальную клетку генетическую информацию. Происходит биосинтез компонентов, необходимых для репродукции. На начальных этапах синтезируются "ранние белки" - ферменты, осуществляющие репликацию фаговой ДНК с целью образования множества ее копий. Затем на клеточных рибосомах формируются структурные "поздние белки"

4. Морфогенез фага . Созревание фага происходит по трем независимым ветвям в различных участках клетки, является разобщенным процессом. Отдельно формируются головки фага - вокруг молекулы ДНК строится капсид. Независимо идет построение отростка. Отдельно синтезируются нити отростка. Затем все составные части фага объединяются, образуя вирионы.

5. Лизис бактериальной клетки и выход фага. Лизис осуществляется под действием лизоцима. Выход путем отпочковывания.

Строгая специфичность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипирования и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.

Метод фаготипирования бактерий широко применяется в микробиологической практике. Он позволяет не только определить видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее фаготип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго определенные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использование наборов таких типоспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний:(установления источника инфекции и путей ее передачи)

II. Фаги применяют для профилактики и лечения инфекционных заболеваний:

а) фагопрофилактика - метод предупреждения развития некоторых бактериальных инфекций с помощью приема внутрь специфического бактериофага. Применяют для профилактики холеры, дизентерии, брюшного тифа и др.

б) фаготерапия- метод лечения бактериальных инфекций посредством приема внутрь специфического фага. (брюшнотифозного, сальмонеллезных, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фага и комбинированных препаратов. Их используют в терапии инфекционных заболеваний, вызываемых вышеперечисленными микроорганизмами, а также в терапии раневых и анаэробных инфекций.)

Генотипическая изменчивость

Патогенность -

Адгезия

Инвазия

Агрессия .

4.Строение генетического аппарата прокариот. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Генетические основы патогенности бактерий.

Генетический аппарат прокариот - не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу

Фенотипическая изменчивость – модификации(изменение не одного или нескольких признаков)– не затрагивает генотип. Изменения Фенотипическая происходят под влиянием факторов внешней среды.Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу.

Генотипическая изменчивость - изменение свойств бактерий,застрагивая их генотип. Передается по наследству, является долговременной. Возникает в следствие мутаций или генетического обмена(трансформации, конъюгации или трансдукции)

Патогенность - видовой признак, передающийся по наследству, закрепленный в геноме микроорганизма т. е. это генотипический признак, отражающий потенциальную возможность микроорганизма проникать в макроорганизм и размножаться в нем (инвазионность), вызывать комплекс патологических процессов, возникающих при заболевании.

К факторам патогенности относят способность микроорганизмов прикрепляться к клеткам (адгезия), размещаться на их поверхности (колонизация), проникать в клетки (инвазия) и противостоять факторам защиты организма (агрессия).

Часть из них кодируется непосредственно генами нуклеоида (например, капсула и ферменты у некоторых видов). Другая часть кодируется внехромосомными факторами наследственности – плазмидами и эписомами. Плазмидные гены обычно определяют взаимодействие возбудителей с эпителием, а хромосомные – существование и размножение бактерий внеклеточно в органах и тканях.

Адгезия Структуры, ответственные за связывание микроорганизма с клеткой называются адгезинами и располагаются они на его поверхности.У грамотрицательных бактерий адгезия происходит за счет пилей I и общего типов. У грамположительных бактерий адгезины представляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стенки. У других микроорганизмов эту функцию выполняют различные структуры клеточной системы: поверхностные белки, липополисахариды, и др.

Инвазия фермент гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, и, таким образом, повышает проницаемость слизистых оболочек и соединительной ткани. Нейраминидаза расщепляет нейраминовую кислоту, которая входит в состав поверхностных рецепторов клеток слизистых оболочек, что способствует проникновению возбудителя в ткани.

Агрессия К факторам агрессии относятся: протеазы - ферменты, разрушающие иммуноглобулины; коагулаза - фермент, свертывающий плазму крови; фибринолизин - растворяющий сгусток фибрина; лецитиназа - фермент, действующий на фосфолипиды мембран мышечных волокон, эритроцитов и других клеток.

1. В медицине:

Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый,стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие.

Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция).

2. В биологии

Бактериофаги M13, фаг Т4, T7 и фаг л используют для изучения белок-белковых, белок-пептидных и ДНК-белковых взаимодействий методом фагового дисплея.

Поскольку размножение бактериофага возможно только в живых клетках, бактериофаги могут быть использованы для определения жизнеспособности бактерий. Данное направление имеет большие перспективы, поскольку, одним из основных вопросов при разных биотехнологических процессах является определение жизнеспособности используемых культур.

ПРЕИМУЩЕСТВА БАКТЕРИОФАГОВ ПЕРЕД АНТИБИОТИКАМИ:

• · высокоэффективные биологические препараты антибактериального действия для профилактики и лечения острых кишечных инфекций и гнойно-воспалительных заболеваний, лечения дисбактериозов;
• · при применении не нарушают нормального биоценоза человека (в отличии от антибиотиков, после которых всегда надо лечить дисбактериоз - Прим. автора);
• · незаменимы при устойчивости возбудителей к антибиотикам;
• · могут применяться в комплексной терапии с другими лекарственными средствами;
• · необходимы при лечении дисбактериозов в комплексе с препаратами, нормализующими микрофлору кишечника;
• · рекомендованы взрослым и детям;
• · изготавливаются с применением природного сырья.

К преимуществам бактериофаговых препаратов относятся узкая специфичность действия, не вызывающая, в отличие от антибиотиков, угнетения нормальной микрофлоры. Доказано стимулирующее действие стафилококкового бактериофага на бифидобактерии -- важнейший компонент микробиоценоза кишечника. Использование бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний стимулирует факторы специфического и неспецифического иммунитета, что особенно эффективно для лечения хронических воспалительных заболеваний на фоне иммунодепрессивных состояний, бактерионосительства.

И антибиотики, и бактериофаги действуют непосредственно на микробы, только антибиотики губят не только патогенную, но и нормальную микрофлору, нарушая естественный баланс, в то время как бактериофаги действуют только на патогенные микроорганизмы. Встречая чувствительную микробную клетку, фаг проникает внутрь нее, переключает механизм ее действия на воспроизводство себе подобных, которые, разрывая оболочку клетки, в десятикратном количестве атакуют другие микробы. Лизис приобретает спонтанный характер, и освобождение от нежелательных микробов происходит в считанные часы. Следует упомянуть также комплексные препараты, представляющие собой набор фагов сразу к нескольким возбудителям: это пиобактериофаг для лечения гнойно-септических заболеваний и интестибактериофаг против кишечных инфекций.

Основными производителями бактериофагов у нас в стране являются НПО "Иммунопрепарат" (Уфа), предприятие по производству бактерийных препаратов (Нижний Новгород), МП "Биофон" (Саратов), НПО "Биомед" (Пермь).

Клиническая практика показала эффективность использования бактериофагов при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, а также при воспалительных заболеваниях пазух носа, ротовой полости, верхних дыхательных путей, мочеполовой системы, холециститах и др., вызванных бактериями, чувствительными к фагу. Однако фаги, эти "природные санитары", могут быть использованы не только для лечения, но и для профилактики инфекционных заболеваний. Они не токсичны, не имеют противопоказаний к применению, могут быть использованы в сочетании с любыми другими лекарственными препаратами. Их можно назначать беременным, кормящим матерям и детям любого возраста, включая недоношенных.

Основным условием их успешного применения является проверка выделенной культуры на чувствительность к соответствующему фагу. Отмечена удивительная закономерность: в отличие от антибиотиков, чувствительность клинических штаммов микроорганизмов к бактериофагам стабильна и имеет тенденцию к росту, что можно объяснить обогащением лечебных препаратов новыми расами фагов.

Препараты бактериофага назначают внутрь при заболеваниях внутренних органов либо местно, непосредственно на очаг поражения. Действие фага проявляется уже через 2-4 часа после его введения (что особенно важно в условиях реанимации). Бактериофаги проникают в кровь, лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути. В 20-е годы фаги активно использовались при лечении различных заболеваний.

Впервые, предположение, что бактериофаги являются вирусами сделал. Д.Эррель. В дальнейшем открыты вирусы грибков и тд, называть стали фаги.

Морфология фага.

Размеры - 20 - 200нм. Большинство фагов имеют форму головастиков. Наиболее сложно устроенные фаги состоят из многогранной головки, в которой располагается нуклеиновая кислота, шейка и отростки. На конце отростка располагается базальная пластинка, с отходящими от нее нитями и зубцами. Эти нити и зубцы служат для прикрепления фага к оболочке бактерии. У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент - лизоцим . Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму. У многих фагов отросток окружен чехлом, который у некоторых фагов может сокращаться.

Различают 5 морфологических групп

1. Бактериофаги с длинным отростком и сокращающимся чехлом
2. Фаги с длинным отростком, но не сокращающимся чехлом
3. Фаги с коротким отростком
4. Фаги с аналогом отростка
5. Нитевидные фаги

Химический состав.

Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белков. Большинство из них содержит 2хнитевую ДНК, замкнутую в кольцо. Некоторые фаги содержат одну нить ДНК или РНК.

Оболочка фагов - капсид , состоит из упорядоченных белковых субъединиц - капсомеров.

У наиболее сложноорганизованных фагов в дистальной части отростка, содержится фермент - лизоцим . Этот фермент способствует растворению оболочки бактерий при проникновении фаговой НК в цитоплазму.

Фаги хорошо переносят замораживание, нагревание до 70, высушивание. Чувствительны к кислотам, УФ и кипячению. Фаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействую со специфическими рецепторами клеток.

По специфичности взаимодействия -

Полифаги - взаимодействующие с несколькими родственными видами бактерий

Монофаги - видовые фаги - взаимодействуют с одним видом бактерий

Типовые фаги - взаимодействуют с отдельными вариантами бактерий внутри вида.

По действию типовых фагов вид можно разделить на фаговый ряд . Взаимодействие фагов с бактериями может протекать по продуктивному, апродуктивному и интегративному типу.

Продуктивный тип - образуется фаговое потомство, а клетка лизируется

При апродуктивном - клетка продолжает существовать, процесс взаимодействия обрывается на начальной стадии

Интегративный тип - геном фага интегрирует в хромосому бактерий и сосуществует с ним.

В зависимости от типов взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные взаимодействуют с бактериями по продуктивному типу. В начале происходит абсорбция фага на оболочке бактерий, за счет взаимодействия специфических рецепторов. Имеет место проникновение или пенетрация вирусной нуклеиновой кислоты в цитоплазму бактерий. Под действием Лизоцима в оболочке бактерии образуется небольшое отверстие, чехол у фага сокращается и НК впрыскивается. Оболочка фага за пределами бактерии. Далее осуществляется синтез ранних белков. Они обеспечивают синтез фаговых структурных белков, репликацию фаговой нуклеиновой кислоты и репрессию деятельности бактериальной хромосом.

После этого происходит синтез структурных компонентов фагов и репликация нуклеиновой кислоты. Из этих элементов происходит сборка нового поколения фаговых частиц. Сборка носит название морфогенез, новых частиц, которых в одной бактерии может образовываться 10-100. Далее лизис бактерии и выход нового поколения фагов во внешнюю среду.

Умеренные бактериофаги взаимодействуют либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл идет аналогично. При интегративном взаимодействии - ДНК умеренного фага после попадания в цитоплазму встраивается в хромосому в определенном участке, причем при делении клетки реплицируется синхронно с бактериальной ДНК и вот эти структуры передаются дочерним клеткам. Такая встроенная ДНК фага - профаг , а бактерия, содержащая профаг, называется лизогенной, а явление - лизогения.

Спонтанно, или под влиянием ряда внешних факторов профаг может вырезаться из хромосомы, т.е. переходить в свободное состояние, проявлять свойства вирулентного фага, что будет приводить к образованию нового поколения бактериальных тел - индукция профага .

Лизогенезация бактерий лежит в основе фаговой(лизогенной) конверсии. Под этим понимают изменение признаков или свойств у лизогенных бактерий, по сравнению с нелизогенными того же вида. Изменяться могут разные свойства - морфологические, антигенные и тд.

Умеренные фаги могут быть дефектными - не способными образовывать фаговое потомство не в естественных условиях и в индукции.

Вирион - полноценная вирусная частица, состоящая из НК и белковой оболочки

Практическое применение фагов -

1. Применение в диагностике. В отношение ряда вида бактерий монофаги, используются в реакция фаголизабельности, как один из критериев идентификации культуры бактерии, типовые фаги применяют для фаготипирования, для внутривидовой дифференциации бактерий. Проводятся с эпидимиологоическими целями, для установления источника инфекции и путей устранения
2. Для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций - брюшной тип, стафилококковы и стрептококковые инфекции(таблетки с кислотоустойчивым покрытием)
3. Умеренные бактериофаги применяют в генной инженерии в качестве вектора, способных вносить генетический материал в живую клетку.

Генетика бактерий

Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самовоспроизведению - репликонов. Репликонами является бактериальные хромосомы и плазмиды. Бактериальная хромосома формирует нуклеоид, замкнутым кольцом не связанным с белками и несет гаплоидный набор генов.

Плазмиды представляет собой также замкнутое кольцо молекулы ДНК, но гораздо меньших размеров чем хромосома. Наличии плазмид в цитоплазме бактерий не обязательно, но они придают преимущество в окружающей среде. Крупные плазмиды редуцируются с хромосомой и количество их в клетке небольшое. А число мелких плазмид может достигать нескольких десятков. Некоторые плазмиды способны обратимо встраиваться в бактериальную хромосому в определенном ее участке и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными. Некоторые плазмиды способны передаваться от одной бактерии к другой при непосредственном контакте - коньюгативные плазмиды. Они содержат гены, ответственные за образование F-пилей, формирующих коньюгативный мостик, для передачи генетического материалы.

Основные типы плазмидов-

F - интегративная коньгативная плазмида. Половой фактор, определяет способность бактерий быть донорами при коньюгации

R - плазмиды. Резистентная. Содержит гены, детерминирующие синтез факторов, разрушающих антибактериальные препараты. Бактерии, обладающие такими плазмидами не чувствительны ко многим препаратам. Поэтому формируются устойчивые к препаратам фактор.

Токс плазмиды - детерминирующие факторы патогенности -

Ent - плазмиды - содержит ген за выработку энтеротоксинов.

Hly - разрушают эритроцит.

Подвижные генетические элементы. К ним относятся вставочные - инсерционные элементы . Общепринятое обозначение - Is. Это участки ДНК, способные перемещаться как внутри репликона, так и между ними. Они содержат только гены, необходимые для их собственного перемещения.

Транспозоны - более крупные структуры, обладающие темиже свойствами, что и Is, го помимо они содержат структурные гены, определяющие синтез биологических веществ, например токсинов. Подвижные генетические элементы могут вызывать инактивацию гена, повреждение генетического материала, слияние репликонов и распространение генов в популяции бактерий.

Изменчивость у бактерий.

Все виды изменчивости подразделяют на 2 группы - ненаследственная(фенотипическая, модификационная) и наследственная(генотипическая).

Модификации - фенотипчиеские не наследуемые изменения признаков или свойств. Модификации не затрагивают генотипа, а поэтому не передаются по наследству. Они являются адаптивными реакциями, на изменение каких то конкретных условий внешней среды. Как правило утрачиваются в первом поколении, после прекращения действия фактора.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип организма, а поэтому способна передаваться потомкам. Генотипическая изменчивость подразделяется на мутации и рекомбинации.

Мутации - стойкие, наследуемые изменения признаков или свойств организма. Основа мутаций - качественное или количественное изменение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Мутации могут изменять практически любые свойства.

По происхождению мутации - спонтанные и индуцируемые.

Спонтанные мутации происходит в естественных условиях существования организма, а индцированные возникают в результате направленного действия мутагенного фактора. ПО характеру изменений в первичной структуре ДНК у бактерий различают генные или точковые мутации и хромосомные аберрации.

Генные мутации происходят внутри одного гена и минимально захватывают один нуклеотид. Этот тип мутаций может быть следствием замены одно нуклеотида на другой, выпадения нуклеотида или вставления лишнего.

Хромосомные - могут затрагивать несколько хромосом.

Может быть делеция - потеря участка хромосомы, дупликация - удвоения участка хромосомы. Поворот участка хромосомы на 180 градусов - инверсия.

Любая мутация возникает под действием определенного мутагенного фактора. По своей природе мутагены - физические, химические и биологические. Ионизирующая радиация, рентгеновские лучи, УФ лучи. К химическим мутагенам - аналоги азотистых оснований, саму азотистую кислоту, и даже некоторые лекарственные средства, цитостатики. К биологическим - некоторые вирусы и трансфазоны

Рекомбинация - обмен участками хромосом

Трансдукция - перенос генетического материала с помощью бактериофага

Репарация генетического материала - восстановление возникших в результате мутаций повреждений.

Существует несколько видов репарации

1. Фотореактивация - этот процесс обеспечивается специальным ферментом, который активируется в присутствии видимого света. Этот фермент перемещается по цепочке ДНК и восстанавливает повреждения. Объединяет тимеры, которые образуются при действии УФ. Более значимы результаты темновой репарации. Она не зависит от света и обеспечивается несколькими ферментами - вначале нуклеазы вырезают поврежденный участок цепи ДНК, затем ДНК полимераза, на матрице сохранившейся комплементарно цепи синтезирует заплату, а лигазы вшивают заплатку на поврежденное место.

Репарации подвергаются генные мутации, а хромосомные как правило нет

1. Генетические рекомбинации у бактерий. Характеризуются проникновением генетического материала от бактерии донора в бактерию реципиента с формированием дочернего генома, содержащим генов обеих исходных особей.

Включение фрагмента ДНК донора в рецепиента происходит кроссинговером

Три типа передачи -

1. Трансформация - процесс, при котором происходит передача фрагмента изолированной ДНК донора. Зависит от компетентности рецепиента и состояния донорской ДНК. Компетентность - способность поглощать ДНК. Она зависит от присутствия в клеточной мембране реципиента особых белков и формируется в определенные периоды роста бактерии. Донорская ДНК обязательно должна быть двухцепочечной и не очень большой по размеру. Донорская ДНК проникает через оболочку бактерий, причем одна из цепочек разрушается, другая встраивается в ДНК реципиента.
2. Трансдукция - осуществляется с помощью бактериофагов. Общая трансдукция и специфическая трансдукция.

Общая - происходит при участии вирулентных факторов. В процессе сборки фагов частиц в головку фага по ошибке может включаться не фаговая ДНК, а кусочек хромосомы бактерий. Такие фаги - дефектные фаги.

Специфическая - она осуществляется умеренными фагами. При вырезании, вырезание его строго осуществляется по границе.Встраиваются между определёнными генами и переносят их.

1. Коньюгация - передача генетического материала от бактерии донора рецепиенту, при их непосредственном контакте. Необходимым условием - наличие в клетке донора коньгативного плазмида. При коньюгации за счет пилей образуется коньюгационный мостик, по которому генетический материал передается от донора к пациенту.

Генодиагностика

Комплекс методов, позволяющих выявить геном микроорганизма или его фрагмента в исследуемом материале. Первым был предложен метод гибридизации НК. Основан на использовании принципа комплиментарности. Этот метод позволяет выявить в генетическом материале наличие маркерных фрагментов ДНК возбудителя с помощью молекулярных зондов. Молекулярные зонды представляют собой короткие цепочки ДНК, комплементарные маркерному участку. В состав зонда вводится метка - флюорозром, радиоактивный изотоп, фермент. Исследуемый материал подвергается специальнйо обработке, позволяющей разрушить микрооргнаизмы, высвободить ДНК и разделить ее на одноцепочечные фрагменты. После этого материал фиксируется. Затем выявляется активность метки. Этот метод не отличается высокой чувствительностью. Можно выявить возбудителя лишь при достаточно большом его количестве. 10 в 4 микроорганизмов. Он достаточно сложен технически и требует большого количества зондов. Широкого распространения в практике он не нашел. Был разработан новый метод - полимеразная цепная реакция - ПЦР.

Этот метод основан на способности ДНК и вирусных РНК к репликации, т.е. к саморепродукции. Суть у пациента - является многократное копирование - амплификация in vitro фрагмента ДНК, являющего маркерного для данного микроорганищма. Так как процесс проходит при достаточно высоких температурах 70-90, то метод стал возможен после выделения из термофильных бактерий термостабильной ДНК-полимеразы. Механизм амплификации таков, что копирование цепочек ДНК начинается не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках для создания которых используют так называемые праймеры. Праймеры представляют собой полинуклеотидные последовательности, комплиментарные концевым последовательностям копируемого фрагмента искомой ДНК, причем праймеры не только инициируют амплификацию, но и ограничивают. Сейчас существует несколько вариантов ПЦР характерны 3 этапа -

1. Денатурация ДНК(разделение на 1 цепочечные фрагменты)
2. Присоединение праймера.
3. Комплиментарное достраивание цепей ДНК до 2хцепочечных

Этот цикл длится 1,5-2 минуты. В результате количество молекул ДНК удваивает 20-40 раз. В результате 10 в 8 степени копий. После амплификации производят электрофорез и выделяются в виде полосок. Она проводится в специальном приборе, который называется амплификатор.

Достоинства ПЦР

1. Дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале, без выделения чистой культуры.
2. Очень высокая чувствительность. Теоретически можно обнаружить 1го.
3. Материал для исследования может быть сразу дизенфицировать после забора.
4. 100% специфичность
5. Быстрота получения результатов. Полный анализ - 4-5 часов. Экспресс метод.

Достаточно широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются не культивируемые или трудно культивируемые организмы. Хламидии, микоплазмы, многие вирусы - гепатита, герпеса. Разработаны тест системы для определения сибирской язвы, туберкулеза.

Рестрикционный анализ - с помощью ферментов молекула ДНК разделяется по определенным последовательностям нуклеоидов и фрагменты анализируются поп составу. Таким образом можно найти уникальные участки.

Биотехнология и генная инженерия

Биотехнология это наука, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности живых организмов использует эти биопроцессы, а также сами биологические объекты для промышленно производства продуктов необходимых для человека, для воспроизведения биоэффектов, не проявляющихся в неестественных условиях. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроорганизмы, а также клетки, животных и растений. Клетки очень быстро воспроизводятся, что позволяет за короткое время нарастить биомассу продуцента. В настоящее время биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, экономичнее и технологически доступнее чем другие виды сырья.

Биотехнология использует сами клетки как источник целевого продукта а также крупные молекулы, синтезируемые клеткой, ферменты токсины, антитела и первичные и вторичные метаболиты - аминокислоты, витамины,гормоны. Технология получения продуктов микробного и клеточного синтеза сводится к нескольким типовым стадиям - выбор или создание продуктивного штаба. Подбор оптимальной питательной среды, культивирование. Выделение целевого продукта, его очистка, стандартизация, придание лекарственной формы. Генетическая инженерия сводится к созданию необходимый для человека целевой продукции. Полученный целевой ген сшивают с вектором, а вектором может быть плазмиды и встраивают его в клетку реципиента. Реципиент - бактерия - кишечная палочка, дрожжи. Синтезируемые рекомбинантами целевые продукты, выделяют очищают и используют в практике.

Первыми, были созданы инсулин и человеческий интерферон. Эритропоэтин, гормон роста, монокланальные антитела. Вакцина против гепатита Б.

Практическое применение фагов. Бактерио­фаги используют в лабораторной диагнос­тике инфекций при внутривидовой иденти­фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на­носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко­торый вызвал ее лизис (образование сте­рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова­ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми­ологическое маркирование). Выделение бак­терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

Фаги применяют также для лечения и про­филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, ста­филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен­терально или местно в виде жидких, таблети-рованных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получе­ния рекомбинантных ДНК.

Возбудители эшерихиозов. Таксономия и характеристика. Роль кишечной палочки в норме и патологии. Микробиологическая диагностика энтеральных эшерихиозов. Принципы лечения и профилактики.

Эшерихиозы - инфекционные болезни, возбудителем которых является Escherichia coli.

Различают энтеральные (кишечные) и паренте­ральные эшерихиозы. Энтеральные эшерихиозы - острые инфек­ционные болезни, характеризующиеся преимущественным пора­жением ЖКТ. Они протекают в виде вспышек, возбудителями являются диареегенные штаммы E.coli. Парентеральные эшерихи­озы - болезни, вызываемые условно-патогенными штаммами E.coli - представителями нормальной микрофлоры толстой киш­ки. При этих болезнях возможно поражение любых органов.

Таксономическое положение . Возбудитель - кишеч­ная палочка - основной представитель рода Escherichia, семей­ства Enterobacteriaceae, относящегося к отделу Gracilicutes.

Морфологические и тинкториальные свойства . E.coli - это мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами. В мазках они располагаются беспорядочно, не образуют спор, перитрихи. Некоторые штаммы имеют микрокапсулу, пили.

Культуральные свойства. Кишечная палочка - факультативный анаэроб, оптим. темп. для роста - 37С. E.coli не требовательна к питательным средам и хоро­шо растет на простых средах, давая диффузное помутнение на жидких и образуя колонии на плотных сре­дах. Для диагностики эшерихиозов используют дифференциально-диагности­ческие среды с лактозой - Эндо, Левина.

Ферментативная ак­тивность. E.coli обладает большим набором различных ферментов. Наиболее отличительным признаком E.coli является ее способность ферментировать лактозу.

Антигенная структура . Кишечная палочка обладает со­матическим О-, жгутиковым Н и поверхностным К -антигена­ми. О-антиген имеет более 170 вариантов, К-антиген - более 100, Н-антиген - более 50. Строение О-антигена определяет принадлежность к серогруппе. Штаммы E.coli, имеющие присущий им набор антигенов (ан­тигенную формулу), называются серологическими вариантами (серовары).

По антигенным, токсигенным, свойствам разли­чают два биологических варианта E.coli:

1) условно-патоген­ные кишечные палочки;

2) «безусловно» патогенные, диареегенные.

Факторы патогенности . Образует эндотоксин, обладающий энтеротропным, нейротропным и пирогенным действием. Диареегенные эшерихии продуцируют эк­зотоксин вызывающий значительное на­рушение водно-солевого обмена. Кроме того, у некоторых штам­мов, как и возбудителей дизентерии, обнаруживается инвазивный фактор, способствующий проникновению бактерий внутрь клеток. Патогенность диареегенных эшерихии - в возникновении геморрагии, в нефро-токсическом действии. К факторам патогенности всех штам­мов E.coli относятся пили и белки наружной мембраны, способствующие адгезии, а также микрокапсула, препятству­ющая фагоцитозу.

Резистентность. E.coli от­личается более высокой устойчивостью к действию различных факторов внешней среды; она чувствительна к дезинфектантам, быстро погибает при кипячении.

Роль E.coli . Кишечная палочка - представитель нормаль­ной микрофлоры толстой кишки. Она является антагонистом патогенных кишечных бак­терий, гнилостных бактерий и грибов рода Candida. Кроме того, она участвует в синтезе витаминов группы В, Е и К, частично расщепляет клетчатку.

Штаммы, обитающие в толстой кишке и являющиеся условно-патогенны­ми, могут попасть за пределы ЖКТ и при снижении иммуни­тета и их накоплении стать причиной различных неспецифичес­ких гнойно-воспалительных болезней (циститов, холециститов) - парентеральных эшерихиозов.

Эпидемиология. Источник энтеральных эшерихиозов - больные люди. Механизм заражения - фекально-оральный, пути передачи- алиментарный, контактно-бытовой.

Патогенез. Полость рта.Попадает в тонкую кишку, адсорбируется в клетках эпителия с помощью пилей и белков наружной мембраны. Бактерии размножаются, погибают, осво­бождая эндотоксин, который усиливает перистальтику кишеч­ника, вызывает диарею, повышение температуры тела и другие симптомы общей интоксикации. Выделяет экзотоксин - тяжелая диарея, рвоту и значительное нарушение водно-солевого обмена.

Клиника. Инкубационный период составляет 4 дн. Бо­лезнь начинается остро, с повышения температуры тела, болей в животе, поноса, рвоты. Отмечаются нарушение сна и аппе­тита, головная боль. При геморрагической форме в кале обнаружи­вают кровь.

Иммунитет. После перенесенной болезни иммунитет не­прочный и непродолжительный.

Микробиологическая диагностика . Основной метод - бак­териологический. Определяют вид чистой культуры (грамотрицательные палочки, оксидазоотрицательные, ферментирующие глю­козу и лактозу до кислоты и газа, образующие индол, не образую­щие сероводород) и принадлежность к серогруппе, что позволяет, отличить условно-патогенные кишечные палочки от диареегенных. Внутривидовая идентификация, имеющая эпидемиологичес­кое значение, заключается в определении серовара с помощью диагностических адсорбированных иммунных сывороток.

83. Структура и функции иммунной системы.

Препараты фагов применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике - для определения фагочувствительности и фаготипироваиия при идентификации микроорганизмов. Действие фагов основано на их строгой специфичности. Лечебно-профилактическое действие фагов обусловливается литической активностью самого фага, а также иммунизирующим свойством находящихся в фаголизатах компонентов (антигенов) разрушенных микробных клеток, особенно в случае неоднократного применения. При получении препаратов фагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответственно типичные культуры микроорганизмов. Бактериальную культуру в жидкой питательной среде, находящуюся в логарифмической фазе размножения, заражают маточной взвесью фага.

Лизированную фагом культуру (обычно на следующий день) фильтруют через бактериальные фильтры и к фильтрату, содержащему фаг, в качестве консерванта добавляют раствор хинозола.
Готовый препарат фага представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета. Для более длительного хранения некоторые фаги выпускаются в сухом виде (в таблетках). При лечении и профилактике кишечных инфекций фаги применяют одновременно с раствором гидрокарбоната натрия, так как кислое содержимое желудка разрушает фаг. Сохраняется фаг в организме недолго (5-7 дней), поэтому рекомендуется применять повторно.

В Советском Союзе выпускались следующие препараты, используемые для лечения и профилактики заболеваний: брюшнотифозный, сальмопеллезный, дизентерийиныи, колифаг, стафилококковый фаг и стрептококковый. В настоящее время фаги применяют для лечения и профилактики в сочетании с антибиотиками. Такое применение оказывает более эффективное действие на антибиотикоустойчивые формы бактерий.

Диагностические бактериофаги широко применяются для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время разработаны фагодиагностика и фаготипирование бактерий рода Salmonella, Vibrio и стафилококков. Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических.
В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.